DB11T 987-2013 鲟鱼种质鉴定规范

ICS65.150B50备案号:38199-2013DB11北京市地方标准DB11/T987—2013鲟鱼种质鉴定规范Rulesofsturgeongermplasmidentification2013-06-21发布2013-10-01实施北京市质量技术监督局发布DB11/T987—2013I目次前言.................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13学名与分类.........................................................................14生物学特征.........................................................................15生长与繁殖.........................................................................26遗传学特征.........................................................................37检测方法...........................................................................58检测规则...........................................................................7参考文献..............................................................................8DB11/T987—2013II前言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由北京市农业局提出。本标准由北京市农业标准化技术委员会归口。本标准由北京市农业局组织实施。本标准起草单位：北京市水产科学研究所。本标准主要起草人：胡红霞、朱华、董颖、田照辉、王巍。DB11/T987—20131鲟鱼种质鉴定规范1范围本标准适用于西伯利亚鲟（Acipenserbaerii）种质的检测和鉴定。本标准给出了西伯利亚鲟的学名与分类、主要生物学特征、生长与繁殖、遗传学特征及检测方法。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB17716青鱼GB/T18654.2养殖鱼类种质检验第2部分抽样方法3学名与分类3.1学名西伯利亚鲟（Acipenserbaerii）3.2分类地位属鲟形目（Acipenseriformes）,鲟科（Acipenseridae）,鲟属(Acipenser)。4生物学特征4.1外部形态鱼体修长，呈纺锤形，横切呈五角形，向尾部延伸变细，吻长尖，口腹位，口裂较小，一字形。歪形尾，鳃盖骨愈合为一,鳃盖膜彼此不相连而与颊部相连。体裸露无鳞具五列骨板，1列背骨板，2两列侧骨板，2列腹骨板；第一背骨板不是最大的骨板,身体最高点不在第一骨板处；侧骨板通常与躯干部颜色相似；腹骨板与背骨板间具有许多星状薄骨板或微小颗粒，吻须4根，介于吻突与口裂之间，稍靠近口裂。鳃耙有结节，一般为3个。鱼体背部呈淡灰黑色或暗褐色，两侧较淡，腹部为白色。西伯利亚鲟的外部形态见图1。DB11/T987—20132图1西伯利亚鲟外部形态图（引自FAO）4.2可数性状背鳍鳍式：D.30～56。臀鳍鳍式：A.17～33。背骨板数：10～20。侧骨板数：37～56，通常为42～47。腹骨板数：7～16。第一鳃弓（左）外侧鳃耙数：20～49，通常为27～32。4.3可量性状比例西伯利亚鲟鱼种、成鱼和亲鱼的可量性状比例见表1。表1西伯利亚鲟的可量性状比例（平均值±标准差）项目年龄鱼种（8月龄）成鱼（3龄）亲鱼（10龄）全长/体长a1.31±0.041.25±0.061.28±0.04体长/体高6.65±0.646.15±0.045.53±0.51体长/头长3.69±0.253.79±0.344.09±0.28头长/吻长1.74±0.172.09±0.182.09±0.17头长/眼径22.13±1.9723.52±6.7223.70±4.21头长/眼间距3.59±0.483.17±0.393.29±0.30头长/尾柄高8.47±1.236.39±1.515.75±1.01尾柄长/尾柄高2.84±0.642.28±0.572.5±0.52a采用从吻端到尾鳍基部的长度5生长与繁殖5.1生长DB11/T987—20133在人工养殖条件下,不同年龄组的西伯利亚鲟鱼体长和体重范围见表2。表2西伯利亚鲟各年龄组体长和体重范围年龄a12345体长cm40～5050～7070～8590～100100～120体重g400～6001500～20003000～40005000～70007000～9000a依据北方地区流水养殖模式，年龄以周年计5.2繁殖性成熟年龄：自然条件下雌鱼为19龄～20龄，雄鱼为17龄～18龄；人工养殖条件下雌鱼为7龄以上，雄鱼为5龄以上。繁殖周期：野生状态下为2年以上；人工养殖条件下为1年以上。怀卵量占体重的10%～30%。6遗传学特征6.1细胞遗传学特征采用流式细胞仪测定西伯利亚鲟鱼细胞中DNA含量为N=8.98±0.115pg。6.2生化遗传学特征西伯利亚鲟肝脏酯酶（EST）同工酶有6条酶带，电泳图及酶带电泳模式图见图2。1为电泳图谱，2为模式图图2西伯利亚鲟肝脏酯酶电泳图谱及模式图6.3分子遗传学标记6.3.1西伯利亚鲟特异性RAPD遗传图谱的建立及特征标记RAPD引物（CCGCCCAAAC）PCR扩增的结果如图3所示。DB11/T987—20134图3RAPD引物的扩增产物1为西伯利亚鲟池，2、3为西伯利亚鲟个体，4为marker6.3.2西伯利亚鲟微卫星DNA分子标记的建立采用14对微卫星引物进行基因型鉴定，西伯利亚鲟在这14对引物的等位基因长度范围见表3。基因型数据分析结果见图4。表314个微卫星引物序列及其在西伯利亚鲟的等位基因长度范围位点名称引物序列(5’-3’)等位基因长度范围(bp)Atr-1101F:TATCCCCTCCACTGGAAATR:GTTAAACATCCCTGCCTTCA143～203Atr-105F:CGATTTGATTGGCTCTTGTAR:TGCAAATAAATTGGAGCTGA157～173Atr-107F:GGCAGGATTACATCTCCTGAR:TTACTAACTGCTAGATAATACCTCTCT188～242Atr-109F:ACCCGAGCTGTCACATTACTR:AAAATAACGCGAATTCCTGA162～300Atr-114F:GCAATTCGTGTTATGTTCATTTR:TGCATTCAGAGAATAACCGA201～251Atr-117F:TGCATGACACAGGACTTACCR:TGCCTCTCAATAGCAACATC191～259Abr39F:ACCCGCAATTATTAGGACR:CAGGACAAACTCAGACCC178～276Abr40F:TCACGCAGTCTCACAAGGR:TTCAATGGCAAACAGCAC384～418Abr41F:ACACTATCCCGCCACAATR:CCACTGAAGCCATCATCT322～410Afu19F:CATCTTAGCCGTCTGTGGTACR:CAGGTCCCTAATACAATGGC120～139Afu22F:TCCACAATCCTGAATAATGACR:GCACCATCTAATACGAAATTG140～242Afu39F:TTCTGAAGTTCACACATTGR:ATGGAGCATATTGGAAGG119～140Afu54F:CTCTAGTCTTTGTTGATTACAGR:CAAAGGACTTGAAACTAGG149～221Afu68F:TTATTGCATGGTGTAGCTAAACR:AGCCCAACACAGACAATATC128～250DB11/T987—20135图4微卫星标记基因型数据分析结果图7检测方法7.1繁殖力检测按照GB17716的生物测定方法。7.2细胞遗传学特征测定7.2.1采鲟鱼尾动脉血0.5ml，加入肝素处理过的1.5mL小指管中，低速（1000rpm）离心3min，弃上清。用0.8%的生理盐水洗涤三次后，在管中加满70%的冷乙醇固定过夜，注意固定时使细胞充分散开。7.2.2取细胞悬液浓度调整到106cell/ml样品1ml，用RNA酶10μg/ml～20μg/ml37℃水浴消化0.5h；碘化丙碇50μg/ml4℃染色30min。7.2.3将处理过的样品用细绢布过滤后，加入适量的同样处理的鸡血红细胞，上流式细胞仪测定荧光强度，计算西伯利亚鲟鱼与鸡血细胞（N=2.8pg）荧光强度之比，即可得到鲟鱼的DNA含量。7.3生化遗传学特征测定7.3.1试验材料西伯利亚鲟30尾以上。7.3.2样品制备剪断鱼的尾动脉，放血。随后解剖，迅速摘取肝组织0.5g左右，置于0℃生理盐水中，用生理盐水洗去组织血污。然后称重，放入玻璃匀浆器中，按1:5（g/ml）的比例加入0.1MpH7.0的冰冷磷酸缓冲液中进行冰浴匀浆。匀浆后在4℃冰箱放置1小时，4℃条件下，12000rpm离心30min，吸取上清液，分装于0.5ml离心管中，-80℃低温冰箱中保存，供同工酶电泳分析用。7.3.3电泳分析7.3.3.1电泳分离条件：电泳缓冲液0.2Mtris-GlypH8.3，分离胶为10%，浓缩胶为4%，小型双垂直电泳槽电泳电压100V，电泳时间为9h～10h，之后改为电压60V，电泳时间为6h～7h。7.3.3.2加样及电泳：每槽加样7μl，与等体积的溴酚蓝蔗糖液混匀后加样，在4℃冰箱中进行电泳。7.3.3.3染色：将α-萘酚0.1g和β-萘酚0.1g溶解于10ml丙酮中，加0.2M磷酸缓冲液至100ml，加固蓝0.1g配成染色液。凝胶板在37℃与染色液，保温30min～50min，即可呈现棕红色同工酶区带，用蒸馏水冲洗3次后，7%醋酸固定。7.4分子遗传学标记方法表示西伯利亚鲟品种池表示非西伯利亚鲟样品DB11/T987—201367.4.1试验材料从西伯利亚鲟群体中分别随机抽取同龄鱼30尾以上，进行尾椎静脉采血，ACD抗凝，去除血浆后-20℃保存。或剪取西伯利亚鲟鳍条约0.5g，置于75%酒精中常温保存。7.4.2基因组DNA的制备利用常规苯酚/氯仿法抽提个体基因组DNA，利用紫外分光光度法确定DNA浓度，将个体基因组DNA液稀释至浓度10ng/μl；从每个个体基因组的DNA稀释液中取出10μl集于一管中，制成品种的池DNA。7.4.3PCR扩增反应扩增反应总体积为25μl，其中包括摸板DNA30ng、10×PCR缓冲液（含Mg2+）2.5μl、dNTPS（2.5mMeach）2μl、Taq酶（5u/μl）0.3μl、引物1pM（RAPD法和微卫星DNA法分别使用各自的引物）。RAPD法反应程序为：95℃预变性5min，94℃45s、36℃45s、72℃90s，45cycles,72℃延伸5min。微卫星DNA法反应程序为：94℃变性45s、退火45s（各引物退火温度详见表4）、72℃延伸45s，40cycles