3酵母工艺学—第三章酵母菌的代谢与生长

《酵母工艺学》第一章酵母概况第二章酵母菌的微生物学概要第三章酵母菌的代谢与生长第四章酵母菌的营养第五章酵母菌的培养原理第六章活性干酵母ADY的生产第七章酵母菌的代谢工程第三章酵母菌的代谢与生长第一节有氧代谢与无氧代谢第二节酵母糖代谢的调节效应第三节乙醇的生成与同化第一节有氧代谢与无氧代谢前言在酵母细胞或细胞组成成分的发酵生产中，要求尽量多地合成酵母细胞，并尽力抑制代谢产物的形成。对于酵母代谢产物的生产，酵母细胞为副产物。所以，需要调节发酵过程使其生成的酵母细胞能满足形成代谢产物所需，而不希望合成过多的酵母细胞，否则会使代谢产物的得率下降。在酵母工业上利用酵母进行生产的产品可分为两大类：1.酵母细胞或细胞组成成分；2.酵母代谢产物。一、酵母菌的有氧代谢（呼吸作用）有氧代谢是指细胞在氧的参与下，通过多种酶的催化作用，把葡萄糖等有机物彻底氧化分解，产生二氧化碳和水，释放能量，生成大量ATP的过程。通常所说的呼吸作用就是指有氧代谢。有氧代谢在细胞质基质和线粒体中进行，且线粒体是细胞进行有氧代谢的主要场所。一、酵母菌的有氧代谢（呼吸作用）第一阶段：糖酵解途径（glycolysis），是细胞将葡萄糖转化为丙酮酸的代谢过程。在酵母菌中，糖酵解途径主要包括EMP途径和HMP途径；EMP途径是酵母菌的主要糖酵解途径；EMP途径是葡萄糖进行有氧或者无氧代谢的共同代谢途径；EMP途径是绝大多数生物所共有的一条主流代谢途径；这一过程是在细胞质基质中进行，不需要氧气；葡萄糖丙酮酸EMP有氧无氧CO2+H2O+能量（大量）C2H5OH（酒精）+CO2+能量（少量）C3H8O3（甘油）+CO2EMP途径:是1分子葡萄糖为底物，经耗能和产能两阶段（10步反应），产生2分子丙酮酸和2分子ATP同时产生2分子NADH（还原型辅酶Ⅰ）的过程。EMP途径的总反应式为：C6H12O6+2Pi+2ADP+2NAD+—→2CH3COCOOH+2ATP+2NADH+2H++2H2OC6葡萄糖2C3甘油醛-3-磷酸2NADH+H+2丙酮酸4ATP2ATP2ATP耗能阶段产能阶段终产物第一阶段可认为是不涉及氧化还原反应及能量释放的准备阶段，只是生成两分子的主要中间代谢产物：甘油醛-3-磷酸。第二个阶段发生氧化还原反应，合成ATP、NADH并形成丙酮酸。在糖酵解过程中，有两分子ATP用于糖的磷酸化，但合成出四个分子的ATP，因此每分解一个分子的葡萄糖净得两个ATP。酵母菌EMP途径的作用供应ATP形式的能量和NADH形式的还原力；连接TCA、HMP等途径的桥梁；为生物合成提供多种中间代谢物；通过逆向反应进行多糖合成；与乙醇、甘油、丙酮的发酵生产密切相关。反应中生成的辅酶NADH不能积存，必须重新氧化为NAD后，才能继续反应。NADH重新氧化的方式随不同的发酵条件而异；酵母菌在无氧条件下，如以乙醛为受氢体，即为酒精发酵；如以磷酸二羟丙酮为受氢体，即为甘油发酵。在有氧条件下，NADH经呼吸链氧化，同时由电子传递磷酸化生成ATP，此时O2分子为受氢体。酵母菌的HMP途径HMP途径是酵母菌的另一条糖酵解途径，但不是主要途径；是从葡萄糖-6-磷酸开始的，HMP途径的一个循环的最终结果是一分子葡萄糖-6-磷酸转变成一分子甘油醛-3-磷酸，三分子CO2和六分子NADPH。一般认为HMP途径合成不是产能途径，而是为生物合成提供大量的还原力（NADPH）和中间代谢产物。如核酮糖-5-磷酸是合成核酸，某些辅酶及组氨酸的原料。另外，HMP途径中产生的核酮糖-5-磷酸，还可以转化为核酮糖-1，5-二磷酸，在羧化酶作用下固定CO2具有重要意义。此外，与EMP途径在果糖-1,6-二磷酸和甘油醛-3-磷酸处连接。进入EMP途径酵母菌的HMP途径一、酵母菌的有氧代谢（呼吸作用）第二阶段：丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶A；第三阶段：乙酰CoA进入三羧酸循环（柠檬酸循环、TCA循环）彻底氧化。TCA循环三羧酸循环，又称柠檬酸循环或者TCA循环：是指在有氧条件下，糖酵解途径生成的丙酮酸经一系列反应被彻底氧化生成CO2和H2O的过程。在各种好氧微生物中普遍存在；真核生物的线粒体和原核生物的细胞质是TCA循环的场所；TCA循环是三大物质分解代谢的最终共同途径和联系枢纽。酵母菌TCA循环的作用TCA循环之所以重要在于它不仅为生命活动提供能量，而且还是联系糖、脂、蛋白质三大物质代谢的纽带；TCA循环所产生的多种中间产物是生物体内许多重要物质生物合成的原料。在细胞迅速生长时期，TCA循环可提供多种化合物的碳架，以供细胞生物合成使用。发酵工业上利用TCA循环生产各种代谢产物。TCA循环总反应式为：C6H12O6+6O2+38ADP+38H3PO4→6CO2+6H2O+38ATP1分子葡萄糖经过糖酵解和TCA循环彻底氧化分解产生38分子ATP；能量利用率：1mol葡萄糖进行氧化分解时共释放出2872.1kJ自由能，1molATP水解成ADP时能放出33.5kJ自由能。因此，葡萄糖进行有氧代谢时能量的利用率为44.3%，远比酒精发酵高（28.6%），其余的能量是以热的形式释放到发酵液中。酵母菌的乙醛酸循环酵母菌能够利用乙酸和乙醇等二碳化合物作为碳源，经乙醛酸循环支路进入TCA循环；异柠檬酸裂解酶将异柠檬酸分解为琥珀酸和乙醛酸，琥珀酸能够进入TCA循环。再在苹果酸合成酶催化下，乙醛酸与乙酰CoA结合生成苹果酸，苹果酸能够进入TCA循环；TCA循环的修改形式，TCA循环的支路。乙醛酸循环的反应。由异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶催化的反应（红色）绕过了三羧酸循环中从异柠檬酸到苹果酸之间的5个反应。+乙醛酸二、酵母菌的无氧代谢无氧代谢是一般是指在无氧条件下，通过酶的催化作用，细胞把糖类等有机物分解成为不彻底的氧化产物，同时释放出少量能量的过程；通常所说的发酵作用就是指无氧代谢。无氧代谢发生在细胞质基质中，不需要氧气的参与；第一阶段：糖酵解途径，即一分子的葡萄糖分解成两分子的丙酮酸。与有氧呼吸的第一阶段完全相同。葡萄糖丙酮酸EMP有氧无氧CO2+H2O+能量（大量）C2H5OH（酒精）+CO2+能量（少量）C3H8O3（甘油）+CO2酵母菌的酒精发酵又叫乙醇发酵，它是酵母菌的正常、典型、常见发酵形式，又称第一型发酵。是指在无氧条件下，酵母菌中的丙酮酸脱羧酶氧化丙酮酸脱羧形成乙醛和CO2，乙醛在乙醇脱氢酶的作用下，被NADH还原为乙醇。糖原1-磷酸葡萄糖6-磷酸葡萄糖葡萄糖6-磷酸果糖1，6-二磷酸果糖3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸2-磷酸甘油酸丙酮酸果糖1,3-二磷酸甘油酸乙醛乙醇酵母菌的酒精发酵酒精发酵总反应式：C6H12O6+2Pi+2ADP—→2C2H5OH+2CO2+2ATP1分子葡萄糖经过酒精发酵（包括糖酵解）后，产生2分子ATP（第二阶段并不产生能量）；能量利用率：发酵1mol葡萄糖能释放234.5kJ自由能，被生物利用的仅为2molATP，1molATP水解成ADP时能放出33.5kJ自由能。因此，酵母菌酒精发酵作用的能量利用率仅为28.6%，远比有氧代谢低（44.3%），其余70%多的能量以热的形式释放到发酵液中。酵母菌的甘油发酵改变正常的发酵条件，可使酵母菌进行第二型发酵和第三型发酵，产生甘油。第二型发酵是在有亚硫酸氢钠的情况下发生的。亚硫酸氢钠和乙醛结合成复合物，致使乙醛不能作为受氢体，而使磷酸二羟丙酮代替乙醛作为受氢体，生成α-磷酸甘油，α-磷酸甘油在α-磷酸甘油磷酸脂酶的催化下水解，除去磷酸，生成甘油。总反应式为：葡萄糖+HSO3--—→甘油+乙醛·HSO3+CO2第三型发酵是在弱碱性条件下进行的。碱性条件可促进甘油的生成，因乙醛不能象正常情况下那样接受氢而还原。而是两分子间起歧化反应，一分子乙醛氧化成乙酸，另一分子则还原成为乙醇，因此没有乙醛来氧化NADH，这时磷酸二羟丙酮又成了NADH的受氢体。总反应式为：2葡萄糖—→2甘油+乙酸+乙醇+CO2用此方法生产甘油，必须在发酵液中流加碳酸钠，保持碱性，否则由于酵母菌产酸使发酵液pH降低，使第三型发酵回到第一型发酵，不积累甘油。第二节酵母糖代谢的调节效应一、巴斯德效应（PasteurEffect）巴斯德在研究酵母菌的酒精发酵时，发现在有氧的条件下，由于呼吸作用的存在，酒精产量大为降低，单位时间内的耗糖速率也减慢，这种呼吸抑制发酵的作用，称为巴斯德效应；氧气浓度高，酵母菌进行有氧代谢。产生能量多、菌体消耗葡萄糖速度慢、菌体对葡萄糖的利用率高；氧气浓度低，酵母菌进行无氧代谢。产生能量少、菌体消耗葡萄糖速度快、菌体对葡萄糖的利用率低；巴斯德效应一般只发生在葡萄糖浓度（＜2g/L）和氮源浓度较低时。二、克雷布特效应（CrabtreeEffect）在有氧的条件下，较高的糖浓度抑制酵母的呼吸作用，并使之进行发酵作用产生乙醇，而酵母得率下降。这种呼吸作用的减弱称之为克雷布特效应。当葡萄糖浓度超过5%时，就会使酵母细胞中呼吸酶的合成和线粒体的形成受到抑制，酵母的生长速率明显下降。由巴斯德效应和克雷布特效应可知，酵母菌的糖代谢途径受到溶解氧和糖浓度的共同影响，使呼吸和发酵作用间彼此相互调节。酿酒酵母一般具有较弱的巴斯德效应和较强的克雷布特效应，在酵母生产时，为了获得较高的酵母收得率，就必须严格控制糖的浓度。三、卡斯特效应（CusterEffect）在有氧条件下，酒香酵母（Brettanomyces）发酵葡萄糖的速度比在无氧的条件下更快，这种氧气对酒精发酵的刺激作用，称为卡斯特效应；在有氧条件下，酒香酵母倾向于酒精发酵；在无氧条件下，酒精发酵反而受到抑制。四、反巴斯德效应（NegativePasteurEffect）来自于酿酒酵母和葡萄酒酵母的早期培养液中的静止细胞，在厌氧条件下，悬浮于适当的缓冲液中，与在空气中比较，显示出强烈的抑制酒精发酵作用，这种现象称之为反巴斯德效应。第三节乙醇的生成与同化由于克雷布特效应的存在，即使培养基中溶解氧的浓度足以满足细胞生长的需要，在含有高浓度的糖时也会产生乙醇。只有当培养基中的有效糖浓度下降到某一临界值时，酵母菌才完全停止发酵，同时消耗乙醇。可发酵性糖浓度随菌种、培养条件以及分析方法不同而异，如：有人得到葡萄糖临界浓度值为0.07g/L，有人得出麦芽糖临界浓度值为0.32g/L，有人得出着蔗糖为底物时可发酵性糖临界浓度值为0.3g/L时，不产乙醇。以酵母细胞为产品的发酵生产中，需要考虑克雷布特效应的存在和糖的临界浓度值。在以酵母细胞为产品的发酵生产中，乙醇的生成将会使细胞的产量下降，而在整个发酵生产中将有效糖的浓度控制在乙醇生成的临界浓度以下是不现实的：糖浓度太低，酵母的生长受到抑制，生长速率将很慢；当糖浓度低于0.1g/L时，采用一般的分析方法测定较困难，因此糖浓度的控制将成为问题。