中国红豆杉内生真菌在7升发酵罐中产紫杉醇的工艺条件研究

陕西理工学院毕业设计第1页共6页中国红豆杉内生真菌在20升发酵罐中产紫杉醇的代谢规律研究[摘要]对1株分离自中国红豆杉的内生真菌，在20升发酵罐中进行液体发酵并测定各时期紫杉醇的含量变化。结果表明：该种内生真菌大量合成紫杉醇是在对数生长末期及稳定期，并在111时紫杉醇含量达到最高即可结束发酵。[关键词]中国红豆杉；内生真菌；液体发酵；紫杉醇引言红豆杉为红豆杉科(Taxaceae)植物，属于裸子植物亚门的古老树种，是冰川活动时期的孑遗植物，为世界上公认濒临灭绝的天然珍稀抗癌植物，在地球上已有250万年的历史。它的生态环境独特，散生于常绿阔叶林或针阔叶混交林，分布虽广，但数量稀少，种群密度小，自身繁殖力弱，生长速度慢[1]；目前，全球红豆杉属植物仅存11种，我国有4种1变种。即东北红豆杉(Taxus.cuspidata.sieb.et.Zucc)、西藏红豆杉(Taxus,wallichiana.Zucc)、云南红豆杉(Taxus.Tunanensis.Chengef.L.K.Fu)、中国红豆杉(Taxus.chinensis.Rehd)、南方红豆杉(Taxus.chinensis.Var.Mairei)[2]。红豆杉属植物在民间早有应用，如云南红豆杉的种子，枝叶就被作为驱虫、通经、利尿的草药应用[3]。美国国家癌症研究中心(NCL)在1958年开始的抗癌植物筛选工作中发现该属植物的树皮提取物有较强的抗肿瘤活性，1963年，E.Wall和M.C.Wani首先从太平洋红豆杉的树皮和根部分离到抗癌活性较强的纯化合物，随后通过X光衍射确定了其结构为一紫杉烷(Taxane)属萜类化合物，即紫杉醇(Taxol)。1971年，M.C.Wani发表了紫杉烷的化学结构。而具有紫杉烷独特骨架的衍生物及其生物碱类约有100个左右，其中多种成分具抗癌瘤作用，以紫杉醇作用最强[4]。紫杉醇(paclitaxel,商品名taxol)，分子式为C47H51O14N，分子量为853192,为一白色结晶体，熔点为213-216℃；微溶于水，易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂。紫杉醇分子在1位、2位和7位各有一个暴露的羟基，除1位的羟基由于在紫杉醇的三维立体结构中位置被屏蔽而呈现较不活泼的惰性外，其它位置的羟基都非常活泼，2位易被酰化，7位易发生氧化和异构化，10位上的乙酰基容易失去而形成去乙酰紫杉醇。紫杉醇13位上带有一长的脂侧链，在一定条件下能分解，脱除脂侧链，形成baccatinIII，碱是紫杉醇脂侧链降解反应的催化剂[27]，也就是说，紫杉醇分子结构很容易发生变化。Schiff等后来证实紫杉醇具有独特的抗癌机制，它作用于细胞微管（Microtuble），通过与微管蛋白N端第31位氨基酸和第217～231位氨基酸结合，诱导和稳定微管蛋白聚合，抑制其解聚，增加聚合程度，使维管束不能与微管组织中心相互连接，将细胞周期阻断于G2/M期，导致有丝分裂异常或停止，阻止癌细胞增殖，它对黑色素瘤及妇女乳腺癌有较强的抑制作用,已作为新型抗癌药用于临床。1992年12月29日，美国食品和药品管理局(FDA)正式批准了紫杉醇作为妇女卵巢癌患者的抗癌药[5]。后又经多年的研究和临床实验,使紫杉醇的抗癌范围逐渐在扩大,目前进行的乳腺癌、肺癌、头颈部癌、软组织癌、白血病和胃肠道癌的临床试验已取得很好的效果，被认为是迄今为止人类发现的最有效的抗癌药物[6]。此外，临床上还观察到它对其他疾病有一定的应用潜力，例如，它具有抗类风湿性关节炎、抗疟的作用，对中风、早老性痴呆和先天性多囊肾病也有一陕西理工学院毕业设计第2页共6页定的疗效。紫杉醇由于其独特的抗癌机制，特别是对普通抗癌药物无能为力的某些晚期肿瘤均有良好疗效。但由于原料和生产技术的限制，全球紫杉醇的产量严重不足，因此价格昂贵，紫杉醇市场已面临供求关系的严重失衡。目前紫杉醇主要是从红豆杉树皮中提取的，红豆杉资源在世界上非常有限，红豆杉科植物生长缓慢，且树皮中紫杉醇含量又低（约万分之二）[7]。加之紫杉醇溶解性差，平均产量约0.015%生产，即每提取lkg紫杉醇需要砍1000～2000棵红豆杉的树皮。据估测（1993年），紫杉醇正式运用于临床以后，全球每年约需200kg以上。按现在的提取率0.03%计算，每年要收集700吨红豆杉树皮来提取，即使将全部的天然资源采伐，也只能满足短期需要。随着该药品应用范围的扩大，所需红豆杉数量将十分可观，这也给红豆杉资源带来严重威胁，直接从红豆杉树皮中提取紫杉醇，必然严重威胁生态平衡，造成对森林和人类环境以及生物多样性不可弥补的损失。并且随着我国对野生红豆杉资源保护措施的不断加强以及对盗伐红豆杉不法行为的严厉打击，利用野生资源生产紫杉醇已无可能，资源已经成为从红豆杉植物中提取紫杉醇的“瓶颈”。在我国，紫杉醇的需求量又十分巨大，虽有5个种，但分布量都非常少，因此红豆杉药用和资源保护形成了尖锐矛盾，寻找紫杉醇未来新的生产途径已成为摆在人类面前的一项重大研究课题[8]。近年来国内外主要从3个领域进行紫杉醇生产的研究，即①化学合成法②植物细胞培养法③微生物工程法[9]。近年来，国内外学者进行了大量红豆杉愈伤组织培养和细胞悬浮培养研究，培养的红豆杉细胞系已超过10个，其中大部分已证实产生紫杉醇，但是离体培养生产紫杉醇实现工业化生产的关键问题难以突破，例如，培养物生物量小，紫杉醇产率较低，生产周期长，并且还需要保持细胞生长与生产特性的稳定等等[9]。Christen首次利用植物细胞悬浮培养技术生产紫杉醇后研究吸引了众多的实验室跟进。ESCAgenefc:公司在1992年NCI主持的第二次紫杉醇研讨会上宣布他们用细胞培养法所得产物紫杉醇含量为树皮的2一5倍。中国的甘烦远[11]等发现云南红豆杉细胞在发酵罐中生长速率达到12g/L,紫杉醇含量为0.119%，约为成年树树皮中含量的12倍，为栽培植株的40倍。但是这项技术同样存在一些问题，即培养细胞的褐化问题等，短期内成功应用的可能性较小。目前人们普遍认为，微生物工程法生产紫杉醇是最具潜在能力、最具可能性的一种方法[10]。植物内生真菌（endophyte）是指生活在植物组织内，对植物组织没有引起明显的病症状的菌，包括那些生活史中某一阶段营表面生的腐生菌，对宿主暂时没有伤害的潜伏性病原菌（Latentpathogens）和菌根菌。植物内生真菌是一类应用前景非常广阔的资源微生物。植物内生菌的研究始于19世纪中叶，DeBary（1986）首次提出植物内生菌一词“endophyte”，在其后几十年中，先后有几十种牧草中发现了内生真菌，近年来的研究表明，几乎所有植物中都有内生菌的存在，且其种类极为丰富。内生菌主要生长在植物的皮下的组织当中，并且植物内生菌长期生活在植物体内的特殊环境中并与宿主协同进化，一方面植物体为其提供生长必须的能量和营养，另一方面，植物内生菌又可通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体产生影响。植物内生菌的生物学作用主要又固氮作用、进植物生长作用和增强宿主植物抗逆境、抗病虫害等。并且植物内生菌能够产生多种全新的活性物质，作为生物防治资源、外源基因的载体和新药的来源，在农业、医药卫生领域有这巨大的应用潜力。随着人们对微生物资源的不断开发，微生物研究领域的不断扩展，微生物研究方法的不断创新和改进，内生菌的研究越来越受科研工作者的重视。利用内生真菌液体发酵的方法具有以下六个优点：①微生物作为工业生产的源泉，可在发酵罐中进行，源源不尽的进行生产；②微生物发酵的方法容易扩大化，发酵成本相对较低，利于工业化生产；③微生物生长仅需要常规的培养技术，在收集紫杉醇前，可通过优化发酵条件、改进技术来提高产量；④微生物易于通过基因工程等方法筛选高产菌株，提高紫杉醇的产量；⑤内生真菌生长迅速，易于培养，所用培养基相对较为经济；⑥可望满足市场的需求，降低紫杉醇的价格[11]。1991年，美国蒙拿大植物病理学系Strobel研究小组从药用植物太平洋红豆杉（Taxusbrevifolia）树皮中分离到1株具有合成与宿主相同抗癌药物—紫杉醇内生真菌（Taxomycesandreanae）[12],内生真菌的研究逐渐成为热点。1993年GaryAStrobel[13]等从短叶红豆杉分离筛选的内生真菌，产率为24～50μg/L；1996年又从喜玛拉雅山红豆杉中分离出另一株产紫杉醇的内生真菌，产率为60～70μg/L[14]；1995年，日本NipponsteelCooporation[15]分离出产紫杉醇真菌，产率为40μg/L；1996年，加拿大NovoPharma公司[16]分离出一株产紫杉醇真菌，其产陕西理工学院毕业设计第3页共6页率高达116mg/L，为目前最高水平。我国邱德有等从云南红豆杉（TYunnanensis）中分离出1株产紫杉醇的内生真菌，但产率非常低，每升产率只能以纳克计量；周东坡[17]等分离出了3株产紫杉醇的内生真菌，产率也仅为51.06～125.7μg/L。陈建华[18]等从云南红豆杉中分离出230余株内生真菌，经检测有5株表现出产紫杉醇特性，其中2株产率较高，约为1mg/L,是我国目前研究的较高水平。由于这些菌株产紫杉醇量很少，目前尚未投入工业性发酵生产。一般来说，发酵产量的水平要达到1mg/L左右才有工业生产价值[19]。但可通过培养基优化、菌株改良等方法提高产量实现紫杉醇的工业化生产。内生真菌是一类应用前景广阔的微生物资源，用微生物发酵的方法生产紫杉醇，是解决药源问题的有效途径[20]。本文通过对1株分离自陕西留坝的中国红豆杉内生真菌在发酵罐中进行液体发酵，旨在研究中国红豆杉内生真菌在20升发酵罐中产紫杉醇的规律，为开发利用这一珍贵的真菌资源提供参考依据。1材料和方法1.1材料1.1.1供试菌株一株分离自中国红豆杉的内生真菌，编号为K10A；由陕西省资源生物重点实验室食用药用菌菌种保藏中心提供。1.1.2主要仪器设备高效液相色谱仪（惠普HP-1100）、电子天平（FA1604型）、20L光照发酵罐（BIOTECH-3000上海保兴生物设备工程有限公司）、烘箱（LRH-250-GS）、人工气候箱（广东省医疗器械厂）、旋转蒸发仪（RE-52AAA，上海嘉鹏科技有限公司）、循环水多用真空泵（SHZ-95B，郑州杜浦仪器厂）、灭菌锅、超净工作台等。1.1.3培养基母种培养基（马铃薯200.0g,葡萄糖20.0g,琼脂20.0g,H2O1000.00mL,KH2PO35g、MgSO4·7H2O3g、VB110mg、pH自然）；液体培养基（马铃薯200.0g,葡萄糖40.0g,H2O1000.0mL,KH2PO32.0g、MgSO4·7H2O0.5g、(NH4)2SO43.0g、蛋白胨5.0g、酵母膏0.8g、VB110mg、pH自然）。1.2方法1.2.1液体发酵（1）菌种活化在试管斜面接入母种，于28℃下活化培养5～7d，待菌丝布满斜面，放入4℃冰箱备用。（2）液体种制备制备液体培养基，分装于三角瓶中,装液量300mL／500mL，于121.3℃灭菌30min，冷却后将已活化的菌株接入液体培养基中，静置培养后转至振荡培养箱，在28℃，160r/min的振荡培养，培养4d，待长出大量菌丝球后，置于4℃冰箱保存，备用。（3）液体发酵设置搅拌轴转速120～210r/min、空气流量1.2L/min、发酵罐内温度28℃、pH6.0；pH电极、溶氧电极及酸碱蠕动泵校准；制备液体培养基14L，由加料口加入发酵罐内，同时加入适量的菜籽油作消泡剂；启动蒸汽发生器对发酵罐内发酵液实罐灭菌，待冷却后放置24h检查各参数确定灭菌是否彻底；将液体种由接种口接入，至此发酵开始。1.2.2紫杉醇萃取每3h抽取发酵液500mL；布什漏斗抽虑过滤发酵液，菌丝体水洗两遍，收集置于烘箱（48℃）烘至恒重；取菌液于65℃旋转蒸发至1/10体积后，加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，收集萃取剂相；将菌丝体放入研钵研磨至菌丝体完全破碎，加入一定量乙酸乙酯超声波提取30min3次，收集乙酸乙酯相。合并