第七章_发酵工艺过程及其控制

发酵工艺原理（第七章）1第七章发酵工艺过程及其控制发酵工艺原理（第七章）2第一节温度的影响及其控制一、温度对生长的影响不同微生物的生长对温度的要求不同，根据它们对温度的要求大致可分为四类：嗜冷菌0～26℃，嗜温菌15～43℃，嗜热菌37～65℃，嗜高温菌65℃以上发酵工艺原理（第七章）3二、温度对发酵的影响温度通过影响微生物的酶反应速度、发酵液中溶解氧而影响发酵；温度影响生物合成方向、酶系组成及酶的特性。温度影响生物合成方向（四环素产生菌）四环素金霉素产物35℃＜30℃温度发酵温度对凝结芽孢杆菌α-淀粉酶热稳定性的影响6～1088～9990℃保持60min残留活性（%）3555发酵温度（℃）温度还影响基质溶解度，氧在发酵液中的溶解度也影响菌对某些基质的分解吸收。因此对发酵过程中的温度要严格控制。发酵工艺原理（第七章）5三、最适温度的控制为了使微生物的生长速度最快和代谢产物的产率最高，在发酵过程中必须根据菌种的特性，选择和控制最合适的温度。温度的选择还要参考其他发酵条件灵活掌握。发酵工艺原理（第七章）6（一）发酵过程引起温度变化的因素1.发酵热发酵热是发酵过程中释放出来的净热量。是引起发酵过程温度变化的原因。发酵热引起发酵液的温度上升。发酵热大，温度上升快，发酵热小，温度上升慢。发酵工艺原理（第七章）7发酵热包括生物热、搅拌热、蒸发热和辐射热等。9生物热是生物氧化过程放出的热。9搅拌热由于搅拌器高速运转，造成液体之间及液体与设备之间磨擦产生的热。9蒸发热因通气使发酵液水分蒸发，由蒸发带走的热。9辐射热因发酵罐液体温度与外界周围环境温度不同，发酵液的部分热通过罐体向外辐射。发酵工艺原理（第七章）8（二）最适温度的选择1、根据菌种及发酵阶段选择微生物种类不同，所具有的酶系及其性质不同，所要求的温度范围也不同。同一种产生菌，菌体生长和积累代谢产物的最适温度往往不同。30～3234～363732～343025生长温度（℃）积累代谢产物温度（℃）棒杆菌（产谷氨酸）黑曲霉（产糖化酶）青霉（产青霉素）发酵工艺原理（第七章）9发酵前期：由于菌量少，发酵目的是要尽快达到大量的菌体，取稍高的温度，促使菌的呼吸与代谢，使菌生长迅速；发酵中期：菌量已达到合成产物的最适量，发酵需要延长中期，从而提高产量，因此中期温度要稍低一些，可推迟衰老。发酵后期：产物合成能力降低，可提高温度，刺激产物合成到放罐。但也有的菌种产物形成比生长温度高。如谷氨酸产生菌生长30～32℃，产酸34～37℃。最适温度选择要根据菌种与发酵阶段的试验结果而定。根据发酵阶段选择发酵工艺原理（第七章）10例：变温培养对乳酸菌高密度培养的影响冯镇，张兰威.中国乳品工业2009：37（7）4-7问题的提出：发酵剂菌体浓度及活力低传统工艺：单一温度恒温培养目的：提高菌体浓度和活力发酵活力：随着培养温度的增加而增加，在37℃达到最大值，然后随着培养温度的进一步增加而下降。生物量：细胞的生物量随着培养温度的增加而增加，井且在39℃达到最大值，之后随着培养温度的增加而减少。结果暗示：在乳酸球菌St98发酵的早期，为了缩短细胞的生长周期和整个批次发酵的时间，采用一个相对比较高的培养温度(如39℃)来进行发酵是比较适宜的，而且在39℃时也可以获得比较高的细胞生物量。发酵工艺原理（第七章）12为了进一步促进细胞的生长和发酵活力的提高，在乳酸球菌St98发酵的早期（0～3.15h）采用相对比较高的温度(39℃)，并在细胞生长的中后期（3.15h后）将温度变换到35℃，对获得较大发酵活力的乳酸菌是有利的。与单一温度发酵相比，乳酸球菌St98的生物量和发酵活力均有所提高。发酵工艺原理（第七章）13例：林可霉素发酵的变温培养冉晓慧颜景斌，安徽医药2003：7（6）468-469问题的提出：菌体浓度升的快、降的也快中后期菌丝衰老过快抗生素合成后劲不足传统工艺：31℃恒温培养，接种后10h左右已进入对数生长期，随后是10h左右的加速生长期，在40h左右对数生长期基本完成，在50h左右转入生产期。目的：维持适度的菌体浓度和延长分泌期发酵工艺原理（第七章）14变温培养的正交设计发酵工艺原理（第七章）16结论：前60h按31℃控制，缩短了适应期使发酵提前转入生产阶段，同时菌丝体已有相当量的积累，为大量分泌抗生素提供了物质基础。60h后将罐温降至3O℃，使与抗生素合成有关的酶的活性增强，抗生素分泌量有所增加，同时因分泌期的延长有利于进一步积累抗生素。发酵进入后期罐温再回升至31℃使生产菌在生命的最后阶段最大限度的合成和排出次级代谢产物。发酵工艺原理（第七章）172、根据培养条件选择温度选择还要根据培养条件综合考虑，灵活选择。通气条件差时可适当降低温度，使菌呼吸速率降低些，溶氧浓度也可髙些。培养基稀薄时，温度也该低些。因为温度高营养利用快，会使菌过早自溶。发酵工艺原理（第七章）18菌体生长快，维持在较高温度时间要短些；菌体生长慢，维持较高温度时间可长些。培养条件适宜，如营养丰富，通气能满足，那么前期温度可髙些，以利于菌的生长。总的来说，温度的选择应根据菌种生长阶段及培养条件综合考虑。要通过反复实践来定出最适温度。3、根据菌体生长情况发酵工艺原理（第七章）191.根据微生物对温度的依赖可将微生物分为哪几类？2.发酵过程的温度有无变化？为什么？3.发酵热的定义。4.生物热的大小与哪些因素有关？5.温度对发酵有哪些影响？6.发酵过程温度的选择有什么依据？思考题发酵工艺原理（第七章）20第二节pH值的控制一、pH值对菌体生长和代谢产物形成的影响pH值不仅可改变底物代谢速率，甚至还可改变代谢途径及细胞结构。N-乙酰谷酰胺谷氨酸谷氨酸产生菌草酸柠檬酸黑曲霉pH5.0～5.8pH7.0～8.0pH中性pH2～3发酵工艺原理（第七章）21微生物生长的最适pH值和发酵的最适pH值往往不一定相同。6.7～7.36.2～6.84.3～5.3发酵pH6.3～6.96.5～7.25.5～7.0生长pH链霉素菌青霉素菌丙酮丁醇菌发酵工艺原理（第七章）22问题1.发酵过程中什么因素影响pH值变化？2.发酵过程如何进行pH的调节与控制？发酵工艺原理（第七章）23二、影响pH值变化的因素微生物种类、培养基的组成和发酵条件均影响发酵过程中的pH值。凡是导致酸性物质生成或释放、碱性物质的消耗都会引起发酵液的pH值下降；反之，凡是造成碱性物质的生成或释放、酸性物质的利用将使发酵液的pH值上升。发酵工艺原理（第七章）24二、影响pH值变化的因素引起发酵液pH下降的因素:1.培养基碳源过多,致使有机酸积累2.生理酸性物质过多,如氨被利用引起发酵液pH上升的因素:1.培养基中氮源过多,氨基氮释放2.生理碱性物质过多，如硝酸钾3.中间补料时氨水或尿素等碱性物质加入过多发酵工艺原理（第七章）25三、发酵过程pH值的调节及控制1.调节培养基的原始pH值，或加入缓冲剂（如磷酸盐）制成缓冲能力强、pH值改变不大的培养基。2.在发酵过程中加弱酸或弱碱进行pH值调节。3.补料调节pH值，即可补充营养，又增加培养基的浓度和减少阻遏作用。氨基酸发酵中pH调节常采用氨水流加法和尿素流加法。发酵工艺原理（第七章）26溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需的条件。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧则往往最易成为控制因素。在28℃,空气中的氧在发酵液中的饱和浓度只有0.22mmol.L-1左右，比糖的溶解度小6000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到饱和浓度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几分钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素。第三节氧的供需及对发酵的影响发酵工艺原理（第七章）27问题1.发酵过程中为何要控制溶解氧？2.发酵液中溶解氧需多大才能满足微生物发酵的要求？3.如何提高发酵液中的溶解氧？发酵工艺原理（第七章）28一、微生物对氧的需求（一）描述微生物需氧的物理量比耗氧速率或呼吸强度（QO2）：单位时间内单位质量的菌体所消耗的氧量，mmolO2·g菌-1·h-1摄氧率(r)：单位时间内单位体积的发酵液所需要的氧量。mmolO2·L-1·h-1。r=QO2.Xr—微生物摄氧率[mmolO2/（L·h）]QO2—菌体呼吸强度[mmolO2/（g干菌体·h）]X—发酵液中菌体浓度（g/L）发酵工艺原理（第七章）29（二）溶解氧浓度对菌体生长和产物形成的影响各种微生物的呼吸强度不同，当液相溶氧浓度CL较低时，QO2随着溶氧浓度的增加而增加，当CL增大到一定时，QO2不再随溶氧浓度的增加而变化，此时的溶氧浓度称为临界溶氧浓度，用Ccr表示。液相溶氧浓度发酵工艺原理（第七章）30当溶解氧浓度高于临界值，微生物的呼吸强度保持恒定，与培养液中溶解氧的浓度无关。当溶解氧低于临界值，微生物呼吸强度随溶解氧浓度的降低而显著下降。细胞的代谢活动会因溶解氧浓度的限制受到影响。临界溶氧浓度Ccr：指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。某些微生物的临界氧浓度1.8～4.9×10-28.2×10-33.1×10-31.5×10-29×10-34.6×10-33.7×10-32.2×10-29×10-33037.815313034.8202430固氮菌大肠杆菌大肠杆菌粘性赛氏杆菌粘性赛氏杆菌酵母酵母橄榄型青霉菌橄榄型青霉菌Ccr/O2mmol/L温度/℃微生物名称发酵工艺原理（第七章）32例：酵母4.6×10-3mmol.L-1,1.8%产黄青霉2.2×10-2mmol.L-1,8.8%微生物的临界氧浓度大约是氧饱和浓度的1%～25%在好氧发酵中，一般将溶氧水平控制在临界值以上，可避免细胞因供氧不足发生代谢异常.但并不是溶氧愈大愈好，因过度供氧操作引起能量消耗并对细胞可能产生伤害，溶氧太大有时反而抑制产物合成。氧的满足度:溶解氧浓度与临界氧浓度之比。发酵工艺原理（第七章）34不同种类微生物的需氧量不同，一般为25～100mmolO2/（L·h），同一种微生物的需氧量，随菌龄和培养条件不同而异。菌体生长和形成代谢产物时的需氧量也往往不同。微生物菌体在不同时期不同阶段的摄氧率[mmolO2/（L·h）]谷氨酸生产菌50132050～55黑曲霉发酵13h种子培养7h产α-淀粉酶生长发酵工艺原理（第七章）36氧的供应不足不但可能引起生产菌种的不可弥补的损失，而且可能导致细胞代谢转向，产生不需要的化合物。供氧对谷氨酸发酵的影响α-酮戊二酸谷氨酸乳酸谷氨酸产生菌供氧过量供氧适中供氧不足发酵工艺原理（第七章）37由于菌体的新陈代谢与有氧呼吸有关，调节通风和搅拌，可影响发酵周期的长短和代谢产物的生成量。只有将发酵液中溶解氧浓度始终维持在各时期的最佳浓度或临界浓度以上，才能使生长或产物生成速率最大。发酵工艺原理（第七章）38一般微生物的临界溶氧浓度很小，发酵过程中供氧是否很容易满足要求？例：以微生物的摄氧率0.025mmolO2·L-1·S-1计，在28℃,空气中的氧在发酵液中的饱和浓度约0.22mmol·L-1，因此达饱和浓度的氧仅能维持细胞代谢时间为：0.22/0.025=8.8秒问题发酵工业上氧的利用率很低，在抗生素发酵方面，被微生物利用的氧不超过空气中含氧量的2%，谷氨酸发酵氧的利用率为10%-30%，大量无菌空气被浪费。发酵工艺原理（第七章）39二、氧的传递和传质方式在深层培养中进行通气供氧时，氧气从气泡传递至细胞内，需要克服一系列阻力，首先氧必须从气相溶解于培养基中，然后传递到细胞内的呼吸酶位置上而被利用。1.从气相主体到汽液界面的气膜传递阻力；2.气液界面的传递阻力；3.从气液界面传递到液膜的传递阻力；4.液相主体的传递阻力；5.细胞或细胞团表面液膜的传递阻力；6.固液界面的传递阻力；7.细胞团内的传递阻力；8.细胞膜的阻力；9.反应阻力。需氧方面的阻力供氧方面的阻力氧从空气泡到达细胞的总传递阻力为上述各阻力之和氧在克服上述阻力进行传递的过程中需要推动力。传递过程的总推动力就是气相与细胞内的氧分压之差或浓度差。由于氧是难溶于水的气体，所以在供氧方面液膜阻力是氧溶于水时的限制因素，若使气泡和液体充分混合而产生湍动可