重组蛋白药物一般生产工艺与质量控制要点

1重组蛋白药物一般生产工艺与质量控制要点起草人/日期：.批准人/日期：.审核人/日期：.文件编号：T09-SS10生效日期：年月日版本号：01培训目的及范围培训目的1、熟悉生物制品一般生产工艺及质量控制要点。2、了解检验项目设置缘由及控制标准。培训范围1、QC部2、QA部23蛋白质的基本性质1、蛋白质大小（一般5-10nm）2、蛋白质形状3、蛋白质核电性4、蛋白质等电点（一般4.0-10.0）5、蛋白质疏水性6、蛋白质溶解度7、蛋白质密度（一般1.3-1.4g/cm3）8、蛋白质与配体结合能力（酶，抗体）9、蛋白质与金属螯合能力（CU2+、ZN2+、CA2+、NI2+）10、蛋白质其它特殊性质(抗热性、抗蛋白酶)基本知识4第一部分：重组蛋白药物一般生产工艺第二部分：重组蛋白药物质控要点第三部分：注射用重组人胸腺肽α1与注射用重组白介素-2（125SER）生产工艺第四部分：注射用重组人胸腺肽α1与注射用重组人白介素-2(125SER)质量控制标准培训内容第一部分：重组蛋白药物一般生产工艺第一步：工程菌构建第二步：菌体发酵与诱导表达第三步：目标蛋白提取与纯化第四步：配液与冻干5重组蛋白药物一般生产工艺第一步：工程菌构6重组蛋白药物一般生产工艺目标产物鉴定基因序列测定表达产物结构确证特异性鉴别实验N末端氨基酸序列分析氨基酸组成分析C末端氨基酸序列分析激光解析飞行时间质谱分析X射线晶体衍射分析7重组蛋白药物一般生产工艺原始菌种鉴定宿主菌鉴定（显微镜、电镜检查，生化反应，对抗生素抗性，质粒检查）质粒检查-遗传稳定性外源因子有：1、细菌检查2、霉菌检查3、支原体检查4、噬菌体检查8重组蛋白药物一般生产工艺第二步：菌体发酵与诱导表达9重组蛋白药物一般生产工艺10第三步：目标蛋白分离与破碎重组蛋白药物一般生产工艺11第三步：目标蛋白分离与破碎重组蛋白药物一般生产工艺第三步：目标蛋白纯化12重组蛋白药物一般生产工艺13第三步：目标蛋白纯化（反相与超滤）重组蛋白药物一般生产工艺蛋白纯化方法14分离方法蛋白质性质基础分离方法蛋白质性质基础沉淀法层析法硫酸铵溶解度离心交换层析电荷及分布丙酮溶解度疏水作用层析疏水性聚乙烯亚胺电荷、大小反相层析疏水性、大小等电点溶解度、等电点亲和层析配体结合双水相法溶解度外源凝集素亲和层析糖基内容与种类电泳法凝胶电泳电荷、大小、形状金属亲和层析金属螯合能力等点聚焦电泳等电点免疫亲和层析特异抗原位点离心法大小、形状、密度层析聚焦等电点超律法大小、形状凝胶过滤层析大小、形状重组蛋白药物一般生产工艺蛋白纯化原理亲和层析离子交换层析疏水层析凝胶过滤层析反相层析15重组蛋白药物一般生产工艺带组氨酸标签的亲和层析组氨酸是具有杂环的氨基酸，每个组氨基酸含有一个咪唑基团，这个化学结构带有很多额外电子，对于带正电的化学物质有静电引力，亲和层析是利用这个原理来进行吸附的，亲和配体（也就是填料）上的阳离子（一般是镍离子）带正电对组氨酸有亲和作用。组氨酸标签是原核表达载体上6-14个组氨酸的区段,这个标签在PH8.0时不带电,且无免疫原性,对蛋白质的分泌,折叠,功能基本上无影响.能高度亲和镍离子,用于蛋白质的亲和纯化16重组蛋白药物一般生产工艺第四步：配液与冻干生物制品药用辅料按使用目的，分为：疫苗培养液生物制品稳定保护剂（人血白蛋白，糖类）免疫佐剂（铝盐，植物油类）防腐剂(硫柳汞与苯酚)脱毒剂与灭活剂（甲醛溶液与b-丙内酯）冷冻干燥保护剂（盐类，糖类，醇类）17重组蛋白药物一般生产工艺冻干过程预冻干一次升华二次升华18重组蛋白药物一般生产工艺典型冻干曲线19第二部分：重组蛋白药物质控要点原辅料、包材、菌种发酵液、原液半成品、成品20重组蛋白药物质控要点原辅料-符合药典和生物制品主要原辅料质控标准等-略包材-符国家药品包装容器（材料）标准-略菌种-符合药典或注册要求发酵液-符合药典或注册要求原液-符合药典或注册要求半成品-符合药典或注册要求成品-符合药典或注册要求21重组蛋白药物质控要点菌种：一般检测项目22中间体名称质量标准检测项目合格标准菌种划种LB平板应呈典型大肠杆菌集落形态，无其他杂菌生长染色镜检应为典型的革兰阴性杆菌对抗生素抗性应与原始菌种相符电镜检查应为典型大肠杆菌形态，无支原体、病毒样颗粒及其他微生物污染生化反应应符合大肠杆菌生物学性状表达量在摇床中培养，应不低于原始菌种表达量质粒检查质粒酶切图谱应与原始重组质粒相符目的基因核苷酸序列检查符合规定质粒稳定性符合规定质粒检查质粒酶切图谱应与原始重组质粒相符重组蛋白药物质控要点发酵液：一般检测项目23中间体名称现质量标准检测项目合格标准发酵菌体表达量≥25%质粒丢失率检查符合规定重组蛋白药物质控要点原液：一般检测项目241生物学活性（有效项目）2蛋白含量（有效项目）3比活测定（有效项目）4纯度测定（有效项目）5分子量（鉴别项目）6紫外吸收光谱（鉴别项目）7肽图（鉴别项目）8等电点（鉴别项目）9N-末端氨基酸序列测定（鉴别项目）10外源性DNA含量（安全项目）11宿主菌蛋白残留量（安全项目）12圆二色谱分析（鉴别项目）12细菌内毒素（安全项目）重组蛋白药物质控要点原液：生物学活性检测生物学活性测定是保证基因工程药物产品有效性的重要手段。参照中国药典标准中的规定及注册质量研究资料，采用脱E受体法或MTT比色法检出本品，专属性强、方法可靠。25重组蛋白药物质控要点原液：蛋白含量检测在质量标准中设定此项目主要用于原液比活性计算和成品规格的控制。目前实际应用最多的是(Lowry)法，也称之为福林一酚试剂法，其灵敏度比双缩脲法高约100倍，比紫外吸收法高约10～2O倍，是蛋白质量化的较可靠方法，具体操作可按照《中国药典》2010年版三部(附录Ⅵ第二法)的规定。参照中国药典三部的标准的规定及本品质量研究资料，此方法能够检出本品，专属性强、方法可靠，能够控制本品含量。如不适用此类方法则采用液相法。26重组蛋白药物质控要点原液：比活测定检测比活性是指单位重量蛋白的活性，反应单位蛋白活性的高低。是活性生物制品的重要指标和检测依据。27重组蛋白药物质控要点原液：纯度检测根据《人用重组DNA产品质量控制技术指导原则》有关要求，应用至少两种不同原理的方法进行纯度分析，且纯度均不得低于95.0％，才能判为合格。因胸腺肽a1与白介素-2（125Ser）在临床上使用剂量在毫克级，故纯度要求应较严格。高效液相法——本检测采用proteinC18反相色谱柱，可精确地测定产品的纯度，及对空间构相作初步分析。一般尽量采用与SDS—PAGE法原理不同的RP—HPLC或其它离子交换HPLC法进行分析，而不采用SEC—HPLC进行分析。电泳法——用SDS—PAGE法分析，可将不同分子量的蛋白质分开，从而测定蛋白质的纯度，通过凝胶扫描仪扫描进行纯度分析。样品在凝胶电泳上显现出条区带，说明样品在该电泳条件分子量是一致的，为分析是否存在相同分子量的杂蛋白，还应选择另一种方法进行纯度分析。28重组蛋白药物质控要点原液：分子量检测分子量是蛋白质理化性质之一。一般采用还原型SDS-PAGE法测定，蛋白质在SDS和B-巯基乙醇存在下沸水浴5min，形成表面带大量负电荷的杆状分子，降低了分子形态和电荷的影响，在电泳过程中蛋白迁移率基本只与其分子量相关，目前广泛用于蛋白分子量的测定。该法具有简便，快速，直观等特点，目前作为基因工程药物原液检定的常规方法。该法可将蛋白质按分子量大小进行分离，因此，可用于蛋白质纯度分析，同时还能对聚合体进行分析。29重组蛋白药物质控要点原液：紫外光谱扫描检测这是基因工程药物的一个重要物理常数，对于一个蛋白质来说，它的最大吸收波长是固定的。对某一重组蛋白质来说，其最大吸收波长是固定的；在生产过程中每批产品的紫外吸收光谱应当是一致的。测定时以生理盐水为对照，在200～350nm范围内对待检样品溶液进行扫描，每批制品紫外吸收图谱应与对照品一致且在280nm附近最大吸收波长应与理论值相符。30重组蛋白药物质控要点原液：肽图检测肽图分析是DNA产品质控的重要手段之一。通过肽图分析，可从一级结构研究重组产品与天然品的同质性。重组产品与天然产品具有相同的指纹图谱，它们具有相同的一级结构。进一步验证了它们的同质性。大多基因工程产品都将肽图分析作为控制其一致性的重要常规指标之一，而采用的方法中．又以HPLC肽图分析最为多见。肽图谱对每一种蛋白质来说是特征和专一的。因此可用于检查各批产品蛋白质一级结构的一致性在肤图分析中的应用基因重组药物的肽图分析是评价基因重组制品和天然蛋白质的同一性以及不同批制品间同一性的重要手段，也是证明细胞遗传稳定性的有效手段之一。31重组蛋白药物质控要点原液：等电点检测不同蛋白质由于某些带电氨基酸带负电荷的Glu，Asp和带正电荷的Lys，Arg,His等的存在，其净电荷各不相同，即等电点各不相同。均一的蛋白质只有一个等电点，有时因加工修饰等影响可出现多个等电点，但应有一定的范围。所以等电点测定是控制重组产品生产工艺稳定性的重要指标。32重组蛋白药物质控要点原液：N-末端氨基酸序列测定可以确证表达产物的编码准确性。对蛋白质的全氨基酸序列分析，难度大，耗时长，从统计学观点只要测定N-末端15个氨基酸便可保证其顺序的正确性。故N-末端15个氨基酸序列分析可作为重组蛋白质的重要鉴别指标。33重组蛋白药物质控要点原液：外源性DNA含量检测宿主细胞DNA只作为一种细胞污染因素而不作为一种危险因素。目前均采用DNA杂交实验，用固相斑点杂交法，以地高辛标记检测试剂盒或者用同位素标记DNA探针进行测定，必须提供相应宿主细胞DNA标准品。由于设备和消耗试剂昂贵，一定程度限制了该方法的普及。由于基因工程药物的生产过程中所使用的各种表达系统中都含有大量的DNA。因此世界各国的药品管理机构都对基因工程药物中所允许的DNA残余量严加限定。WHO和FDA将此限量定在100pg／剂量。参照药典三部附录IXB外源性DNA残留量测定法每1次人用剂量应不高于10ng。34重组蛋白药物质控要点原液：宿主菌蛋白残留量检测如在临床使用中需要反复多次注射的药品，则需要做残余菌体蛋白含量测定，所用方法以双抗体夹心ELISA为宜，尽量不用点免疫。因为用点免疫测菌体蛋白含量，实验结果不客观，主要是因为检品和菌体蛋白标准难以在同等条件下进行直接点膜，当检品浓度较高时，在硝酸纤维膜上形成一定厚度的样品模块，影响了菌体蛋白与膜的结合，导致测定结果偏低。不同表达体系对菌体蛋白含量标准不同，如来自大肠杆菌的产品为不大于0．1％；来自CHO细胞表达产品为不大于0．05％。本检品中宿主蛋白含量应不高于总蛋白的0.1%。35重组蛋白药物质控要点原液：圆二色谱分析对R和L两种圆偏振光吸收程度不同的现象，这种吸收程度的不同与波长的关系称圆二色谱，是测定分子不对称结构的光谱法。用于测定蛋白质的立体结构，核酸和多糖的立体结构。在蛋白质分子中，肽链可形成α-螺旋、β-折叠、β-转角等特定的立体结构。这些立体结构都是不对称的。36重组蛋白药物质控要点原液：圆二色谱检测蛋白质的肽键在紫外185～240纳米处有光吸收，因此它在这一波长范围内有圆二色性。几种不同的蛋白质立体结构所表现的椭圆值波长的变化曲线──圆二色谱是不同的。α-螺旋的谱是双负峰形的，β-折叠是单负峰形的，无规卷曲在波长很短的地方出单峰。蛋白质的圆二色谱是它们所含各种立体结构组分的圆二色谱的代数加和曲线。因此用这一波长范围的圆二色谱可研究蛋白质中各种立体结构的含量。蛋白质含酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,它们在240～350纳米处有光吸收,当它们处于分子不对称环境中时也表现出圆二色性。这一范围的圆二色性反映出在蛋白质分子中上述氨基酸残基环境的性质。37重组蛋白药物质控要点原液：细菌内毒素检测细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分,当细菌死亡或自