微生物学检验--操作流程及评分标准

显微镜的使用操作流程及评分标准项目内容分值扣分标准扣分目的掌握显微镜的使用方法及注意事项用物准备光学显微镜、载玻片、擦镜纸、香柏油、脱油剂素质要求让学生能够熟练使用显微镜操作步骤1.安放：把显微镜放在自己前面略偏左的桌面上，这样便于用左眼观察物像，用右眼看着画图。安放时镜筒向前，镜臂向后。2.对光：转动转换器，使低倍物镜正对通光孔，并使物镜前端与载物台有两厘米左右的距离。然后把反光镜对着光源，但是反光镜不能直接对着太阳。只要视野的光亮程度合适，光就对好了。3.观察：对好光后，把显微镜玻片标本放在载物台上，并使玻片上的标本对着通光孔的中心，再用压片夹夹住。然后慢慢地转动调焦螺旋，直到接近玻片为止。接着，用左眼向目镜内注视，同时反方向转动调焦螺旋，直到看清物像为止。4.再放大：选好一个放大目标，再把要放大的部分移到视野正中心，如果物像不清楚，再转动调焦螺旋。如果还观察不清楚，就必须换用高倍物镜。用高倍物镜观察时，高倍物镜顶端离玻片很近，稍不小心，镜头就会压到玻片，所以要特别小心。5.在显微镜里看到的物像是倒像，因此，要使物像向上移动，就要向下移动玻片；要使物像向左移动，就要向右移动玻片。注意事项1.先用低倍镜观察，用低倍镜能看清的，就不再用高倍镜。2.必须保护好镜头。3.载物台要保持清洁干燥。4.转动调焦螺旋不要用力过猛，以防损伤机件。5.取用显微镜要轻拿轻放，要用右手握镜臂，左手托镜座。6.使用完毕，要把显微镜外表擦干净，并把镜筒旋下至最低处。最后把显微镜放入镜箱，送回原处保存。细菌的形态学检验操作流程及评分标准项目内容分值扣分标准扣分目的掌握革兰染色的基本原理和操作方法用物准备革兰染色液、生理盐水、载玻片、接种环、酒精灯、显微镜、香柏油、蜡笔、擦镜纸、脱油剂素质要求能够熟练对细菌标本进行染色，观察结果，对细菌进行分类操作步骤（1）涂片：取清洁无油迹的载玻片1张，用蜡笔划线将其分成左右两格。用接种环先挑取生理盐水1~2环于载玻片每格中央，再分别挑取大肠杆菌和葡萄球菌少许菌落与生理盐水研匀，涂成直径约1.5cm的菌膜。（2）干燥：让涂片自然干燥，也可在酒精灯火焰较远处微微加热烘干，但切勿靠近火焰。（3）固定：干燥后的标本片在酒精灯火焰上来回通过3次（以钟摆的速度），冷却后染色。固定的目的在于杀死细菌，并使菌膜与玻片牢固粘附，避免染色过程中被水冲洗掉，通过固定还可凝固细胞质，改变细菌对染料的通透性，使细菌易与染料结合而着色。（4）染色：结晶紫---卢戈碘液---95％乙醇----稀释石炭酸复红---待干、镜检（初染）----（媒染）----（脱色）----（复染）注意事项1.革兰氏染色成败的关键是酒精脱色时间。2.染色过程中勿使染色液干涸。3.选用幼龄的细菌。G+菌培养12h-16h，E.coli培养24h。基础培养基的制备与灭菌操作流程及评分标准项目内容分值扣分标准扣分目的掌握基础基础培养基的配制流程、灭菌的方法及注意事项用物准备牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂粉、1mol/LNaOH、1mol/LHCl试管、吸管、平皿、锥形瓶、量筒、吸管、精密PH试纸、天平、滤纸素质要求要求熟练操作培养基的配制和灭菌操作步骤一、培养基的配制1.配制溶液2.调节pH值3.过滤4.分装二、培养基的灭菌1.开盖2.通电3.加水4.放样5.设定温度和时间注意事项1．调节PH值时，要边滴氢氧化钠边搅拌，不能一次加太多2．加热时间控制好，否则培养基会煮糊。3．灭菌是要注意将灭菌锅里的空气排干净。4．注意灭菌的时间和温度的控制。细菌的接种培养法操作流程及评分标准项目内容分值扣分标准扣分目的掌握细菌的接种方法及操作流程用物准备温箱、酒精灯、接种环、接种针、L形玻棒、打火机、记号笔素质要求能够熟练操作各种接种方法操作步骤（一）平板划线接种法（又称分离培养法）烧灼接种环，杀灭环上残留细菌，待冷，从薄膜处取菌作连续平行划线，约占平板表面1/5左右，再次烧灼接种环，等三次平行划线……以同样方法作第四次，第五次划线，将平板表面划完。划线完毕，盖上平皿盖，底面向上，用标签或腊笔注明菌名检验号码，接种者信息等，置37℃孵育培养24小时后观察结果。（二）斜面培养基接种法试管口部于火焰上往返通过2~3次灭菌，将灭菌白金环伸入有菌试管中，取少量细菌，然后移至准备接种的试管中。接种方法是自管底向上连续平划线，若以保存菌为目的时可自管底上划一粗直线即可。取出接种环，将试管上部再经火焰灭菌，塞好棉塞，接种环灭菌后放回原处。（三）半固体培养基穿刺培养法灭菌穿刺针沾取细菌后，垂直刺入半固体培养基中央直达近管底处，再沿原穿刺线抽出即可。注意事项1．选择适合其生长需要的培养基2．防止污染。培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。3．防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌。细菌的分布操作流程及评分标准项目内容分值扣分标准扣分目的熟悉细菌在自然界和人体的分布，了解外界因素对细菌的影响用物准备待测水样、泥土、无菌吸管，平皿，无菌生理盐水素质要求让学生熟悉细菌在自然界和人体的分布情况操作步骤1.空气中细菌的检查（1）方法：取普通平板（或血平板）1个，选室内或室外的一处空间，在离地面1m左右高度的桌面（或台面）上，打开平板盖，让培养基暴露于空气中，10min之后，迅速盖好盖子，在底部写上标记，放35℃培养18~24h，观察结果。（2）结果观察2．水中细菌检查（1）方法：1）用无菌三角烧瓶以无菌的方法采集水样。2）用无菌吸管吸取1ml水样以无菌技术加入无菌平皿中。3）趁热（不烫手为宜），倾注约15ml的普通琼脂，立即在台面上轻轻转动平皿使其混匀。待琼脂凝固后，将其放入35℃，培养18~24h。（2）结果观察报告。3．人体咽喉部细菌检查（1）方法：1）采样持无菌棉拭1根，待受试者张大嘴巴后，迅速伸入对方悬臃垂后的咽喉部，轻轻揩取咽喉壁上的分泌物。2）接种以无菌方法用棉签在琼脂平板的一角(1/4处)来回划线，去掉棉拭，然后用接种环在原划线上过2~3下，接着往下划线分离。3）培养写上标记，将平板放35℃，18~24h培养。注意事项1.注意无菌操作，防止空气或人体上的细菌污染。2．倒入的培养基温度大约在45℃左右（热而不烫手为宜），太热，太冷都不行。细菌对抗药物敏感试验操作流程及评分标准项目内容分值扣分标准扣分目的掌握药敏试验的方法、原理、结果判读、临床意义用物准备供试菌种、普通琼脂培养基、药敏纸片、培养起、平皿、镊子、试管、酒精灯、涂布棒素质要求要求学生熟练操作纸片扩散法操作步骤1．配制培养基2.配制菌悬液3.涂布于琼脂平板的表面4.室温下干燥3-5分钟5.贴药敏纸片6.35℃培养16-18小时7.测量抑菌圈直径，参照相关标准判读结果。注意事项1.培养基的质量2.药敏纸片的质量,含药量和保存方式3.接种菌量正确与否是影响结果的重要因素之一,取决于麦氏比浊标准的配制,正确使用和保存5孵育条件,温度和时间6抑菌圈测量工具的精度7质控菌种本身的药敏特性是否合格,有无变异。糖发酵试验操作流程及评分标准项目内容分值扣分标准扣分目的熟悉葡萄糖发酵试验的原理和操作方法。用物准备大肠杆菌，糖发酵管素质要求熟悉大肠杆菌对葡糖糖的发酵情况。操作步骤1.取两支HL葡萄糖培养基，置沸水中水浴10分钟。2.冷却，将待检细菌接种到2支培养基中。3.取其中一支加灭菌的液体石蜡，使其与空气隔绝，另一管不加液体石蜡4.35℃培养18-24小时，观察结果注意事项配制糖发酵管内装的小倒管在接种细菌前应是无气泡存在的，否则不能进行接种甲基红试验操作流程及评分标准项目内容分值扣分标准扣分目的熟悉甲基红试验的原理和操作方法。用物准备菌种、葡萄糖蛋白胨培养基，甲基红素质要求能利用甲基红试验对大肠杆菌进行鉴定操作步骤1.将待检的细菌接种于葡萄糖蛋白胨水中2.35℃培养18-24小时3.滴加甲基红试剂4.结果：呈红色为阳性，黄色为阴性。注意事项1.注意无菌操作2.注意观察指示剂的变化病毒的分离培养操作流程及评分标准项目内容分值扣分标准扣分目的了解鸡胚培养常见的几种接种方法；掌握鸡胚尿囊腔接种的操作技术。用物准备受精卵、孵卵器，检卵灯，齿钻，磨壳器，钢针，蛋座木架，注射器，2．5%碘酒，70%酒精，镊子，剪刀，封蜡（固体石蜡加1/4凡士林，溶化），灭菌培养皿，灭菌盖玻片等。素质要求要求能够对不同的病毒通过鸡胚进行培养操作步骤一、准备蛋胚二、接种1.绒毛尿囊膜接种将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上，选择血管较少的地方做一记号，并在记号处的卵壳上磨开一三角形小窗，用小镊子揭去所开小窗处的卵壳，小心地划破壳膜，用针尖刺破气室小孔处的壳膜，用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴0．05—0．1ml病毒液于绒毛尿囊膜上。涂上半凝固的石蜡，将鸡卵保持人工气室在上方的位置37℃培养，48—96小时观察结果。2.尿囊腔接种将蛋胚在检卵灯上照视，并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。用碘酒消毒气室蛋壳，并用钢针在记号处钻一小孔。用带18mm长针头的1ml注射器吸取病毒液，针头刺入孔内，经绒毛尿囊膜入尿囊腔，注入0．1ml病毒液。用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72小时。3.羊膜腔接种将孵育10—11天的蛋胚照视，画出气室范围，并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。用齿钻在气室顶端磨一三角形，用镊子揭去蛋壳和壳膜，并滴加灭菌液体石蜡一滴，用镊子，刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方，用26号针头的注射器，刺入羊膜腔内，注入病毒液0．1ml。将卵壳的小窗封住，于37℃孵卵器内孵育48—72小时。4.收获注意事项防止污染：接种全过程要求无菌操作。为减少污染，要求方法简单、操作迅速。（2）温度要适宜，接种过的鸡胚，要根据所接种的病原体生长增殖所需要的温度，置温箱中孵育。