核苷酸类物质(精)

一、概况核酸由众多的单体核苷酸通过3,5－磷酸二酯键聚合而成。核苷酸由碱基、核糖、磷酸组成。脱去磷酸后的碱基称为核苷。第二节核酸与核苷酸发酵（一）呈味核苷酸核苷酸类中的肌苷酸（IMP）、鸟苷酸（GMP）、黄苷酸（XMP）呈强鲜味。如：肌苷酸钠比味精鲜40倍，鸟苷酸钠比味精鲜160倍。5－鸟苷酸5－肌苷酸5－黄苷酸（guanylicacid）（inosinicacid）（xanthylicacid）5-GMP5-IMP5-XMP碱基鸟嘌呤次黄嘌呤黄嘌呤AMPGMP鲜味剂的协同效应当核苷酸与氨基酸类物质混合使用时，鲜味不是简单的叠加，而是成倍地提高。增效：甜味、肉味消除：咸、酸、苦味、腥味、焦味历史•1960年，日本科学家发现5-IMP具有强烈鲜味。•60年代后期，日本成为用发酵法生产核苷酸类物质的最大生产国。•市场上的“强力味精”、“加鲜味精”是在普通的味精中加少量肌苷酸钠组成。•70年代以后，核酸类物质及其衍生物以其具有抗病毒和抗肿瘤的作用，受到医药界的普遍重视。（二）生产方法1.发酵法（1）一步法：直接发酵法（2）二步法（发酵转化法）发酵法核苷核苷酸2.酶解法酵母核糖核酸核苷酸提取酶解磷酸化二、核苷酸的生物合成途径及其代谢调控（一）生物合成途径从头合成途径：利用氨基酸等作为原料合成。补救合成途径：利用体内游离的碱基或核苷合成。1.从头合成途径（denovosynthesis）由氨基酸、磷酸戊糖、CO2和NH3合成核苷酸。嘌呤核苷酸：直接生成次黄嘌呤核苷酸（IMP）,然后转变为其它嘌呤核苷酸。葡萄糖HMP5‘－磷酸核糖磷酸核糖焦磷酸（PRPP）PRPP转酰胺酶5-IMPAMPSAMPXMPGMP①腺苷酸代琥珀酸合成酶③IMP脱氢酶②腺苷酸代琥珀酸裂解酶④GMP合成酶由IMP合成AMP及GMPAMP-SAMPIMPXMPGMPGlnAMPADPATPADPATP激酶ADPATP激酶GMPGDPGTPADPATP激酶ADPATP激酶IMP合成途径的代谢调控主要通过产物的负反馈调节调节包括:2个长反馈和2个短反馈ATPGTPR-5-PATPPRPP合成酶PRPP酰胺转移酶PRAIMPAMPSAMPADPXMPGMPGDP2个长反馈2个短反馈IMPAMPSXMPAMPADPGMPGDPGTPATPATP2.补救合成途径（salvagesynthesis）微生物从培养基中取得完整的嘌呤、戊糖、磷酸，直接合成单核苷酸。当全生物合成途径受阻时，微生物可通过此途径合成核苷酸。有两条合成途径：（1）嘌呤碱与PRPP直接合成嘌呤核苷酸次黄嘌呤次黄嘌呤核苷酸鸟嘌呤鸟嘌呤核苷酸次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)PRPPPPi腺嘌呤腺嘌呤核苷酸腺嘌呤磷酸核糖转移酶（APRT）HGPRT活性高APRT活性低90%嘌呤碱腺嘌呤+1-磷酸核糖腺苷+Pi核苷磷酸化酶（2）腺嘌呤与1-磷酸核糖生成腺苷,再生成腺嘌呤核苷酸。腺苷+ATP腺苷激酶腺苷酸+ADP三、肌苷酸的生产（一）一步法1.肌苷酸生产菌选育（1）解除微生物自身的反馈调节a.解除AMP、GMP对PRPP转酰胺酶的反馈抑制。b.切断5-IMP继续代谢生成GMP和AMP的途径。因此，选择可能产生核苷酸的产氨短杆菌（Brevibacteriumammoniagene）为出发菌株，诱变为腺嘌呤缺陷型突变株，再诱变为鸟嘌呤缺陷型突变株。IMP的阻遏如何解决？（2）改变核苷酸对细胞膜的渗透性核苷或碱基容易透过细胞膜，而核苷酸难于透过细胞膜。日本科学家发现，Mn2+对于产氨短杆菌核苷酸的膜透性起着关键作用，Mn2+限量的情况下，菌体产生膨胀异常现象，细胞膜允许IMP渗透到胞外，积累IMP。Mn2+限量与生物素亚适量结果相同，但机制不同。Mn2+亚适量：培养后期，细胞形态异常（伸长、膨胀、不规则）生物素亚适量：为乙酰CoA羧化酶的辅基，影响脂肪酸生物合成，间接影响细胞膜磷脂合成，从而影响细胞膜透性。2.培养条件（1）因所用菌株为腺嘌呤缺陷型，所以添加适量腺嘌呤（加0.5%酵母膏或酵母水解液）。（2）Mn2+亚适量工业原料和工业用水含较多的Mn2+，难于控制Mn2+亚适量,有两条途径：a.筛选对Mn2+不敏感的突变株b.加抗生素或表面活性剂以解除过量Mn2+的影响。（3）添加较高浓度的磷盐。（二）二步法（肌苷酸生产主要方法）发酵法肌苷肌苷酸原因：•IMP对细胞膜的透性很差。•微生物中普遍存在使IMP脱磷酸化的酶类。磷酸化1.肌苷生产菌的选育常用：枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）的腺嘌呤缺陷型。原因：该菌磷酸酯酶活性强，有利于将IMP脱磷酸化形成肌苷，分泌至胞外，而产氨短杆菌的磷酸酯酶活性较弱。因此，对B.subtilis进行菌种改良，可大量积累肌苷。2.培养条件（1）培养基：碳源：淀粉水解糖或糖蜜氮源：要充分（因肌苷含氮量高，20.9％）无机盐：可溶性磷盐有抑制作用（胞外磷酸化）生长因子：加适量含腺嘌呤的物质，如酵母膏。腺嘌呤的最适浓度：不影响菌体生长使肌苷大量积累（2）发酵条件通气搅拌：供氧充足，促进肌苷生成，并可减少CO2对肌苷生成的抑制。（3）肌苷的提取先过阳离子交换柱，再过活性炭柱（吸附），结晶。3.肌苷的磷酸化（1）酶法：酶：核苷磷酸化酶（三叶草假单胞菌）磷酸的供体：对硝基苯磷酸难点：除5－磷酸化产物外，还有3-、2-位异构体，收率85％。（2）化学法：用不同的磷酸化试剂。4.肌苷酸的提取离子交换法除菌体除对硝基酚柱层析（过滤、离心）活性炭吸附加乙醇沉淀精制（结晶）粗制品肌苷酸四、鸟苷酸的生产•鸟苷酸由鸟嘌呤、核糖和磷酸三部分组成。•1960年，日本科学家发现5‘－鸟苷酸钠具有强烈的鲜味。1961年又证实了香味极浓的著名菇类－香菇含有大量的鸟苷酸，从此开始研究GMP的生产方法。鸟苷酸的生产方法：（1）由酵母细胞提取出核酸，再以酶法降解；（2）直接发酵法生产鸟苷酸；（3）以化学法磷酸化发酵生产的鸟苷；（4）双菌混合发酵法。利用5一黄苷酸或黄苷酸生产菌与能将黄苷酸或黄苷转化为鸟苷酸的菌株混合培养。（一）二步法（常用）1.选用二步法的原因：（1）GMP的细胞膜透性很差（限Mn2+）微生物中普遍存在鸟苷酸的降解酶系（加高浓度磷盐）,培养条件较复杂。（2）直接发酵法产酸率不高，因GMP是嘌呤核苷酸生物合成的终产物，使鸟苷酸的自身合成受阻。（3）鸟苷的溶解度低，容易析出，相对减弱了反馈调节的强度，使积累鸟苷成为可能。2.鸟苷生产菌的选育（鸟苷高产菌株应具备的条件）（1）丧失腺苷酸琥珀酸合成酶活性，即切断肌苷酸到腺苷酸的通路。（2）鸟苷分解酶的活性微弱。（3）解除鸟苷酸的反馈抑制与阻遏。（4）由肌苷酸脱氢酶、鸟苷酸合成酶催化的反应，比核苷酸酶催化的反应优先进行，从而抑制肌苷的产生。按上述要求，利用枯草芽孢杆菌腺嘌呤缺陷型加以诱变获得。3.鸟苷发酵条件（1）培养基碳源：葡萄糖或麦芽糖氮源：硫酸铵（氯化铵、大豆蛋白水解液）、流加氨水无机盐：磷、镁、铁、锰嘌呤前体物：L-谷氨酸钠营养缺陷型菌株的营养物质（2）发酵条件温度：36℃（0~24h）36.5~37.5℃（24h后）pH值：pH值下降，流加氨水。溶氧：发酵周期：48h左右（3）鸟苷的分离提取灭菌后发酵液→除菌体→一次结晶→过滤→鸟苷粗品→脱色→过滤→二次结晶→过滤→鸟苷→烘干→磨粉→包装（二）酶法（又称核酸水解法）起始于日本，50－60年代研制成功，技术关键是筛选到产生5－磷酸二酯酶（核酸外切酶）的菌株。1.原理5－磷酸二酯酶能水解核糖上3－碳原子羟基与磷酸形成的二酯键，生成4种5－单核苷酸，即：从游离3－羟基端开始，逐个水解下5－单核苷酸。特点：工艺简单，得率高，副产物也为医药产品。核酸的降解过程核酸酶（磷酸二酯酶）核苷酸酶（磷酸单酯酶）核苷磷酸化酶核酸核苷酸核苷磷酸嘌呤或嘧啶戊糖-1-磷酸某些核酸外切酶对RNA、DNA均有作用：牛脾磷酸二酯酶3-核苷酸蛇毒磷酸二酯酶5-核苷酸2.磷酸二酯酶的制备（1）桔青霉（Penicilliumcitrinum）可用固体发酵（制曲、浸泡、抽提）（2）金色链霉菌（Streptomycesaureus）液体深层发酵，该菌不仅含有5－磷酸二酯酶，同时含有脱氨酶，使其中的5－AMP脱氨后生成5-IMP。因此，使用该菌产生助鲜剂时，由于含有两种酶，可同时得到IMP和GMP。3.核酸提取（1）鲜酵母制备（2）提取核酸（RNA）干酵母片研碎，10%Nacl沸水浴浸提30min。冰盐浴冷却，离心取上清夜。等电点沉淀。乙醇洗涤，离心，重复3次。干燥，称重。4.核酸酶解核酸溶液5－单核苷酸混合液5.5－鸟苷酸的分离离子交换树脂5－磷酸二酯酶