《基因工程综合实验》实验大纲

附件一：基因工程（跨课程）综合实验讲义基因工程•发酵工艺原理•生物技术药物药剂与药动学广东药学院生命科学与生物制药学院2006年6月（非正式出版物，请勿外传）目录一、实验安排日程表.......................................１二、目的和意义...........................................2三、课程介绍和课堂讨论．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．３四、实验实施．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．７五、实验考核．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．８六、附录．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9附录一：讲义．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．9附录二：知识竞赛规则及试题．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．281一、实验安排日程表上午下午晚上第一周一课程介绍和课堂讨论（黄、邵）准备试剂（董、段）二放大培养（董、段）、动物操作练习（袁、杨）质粒提取（董、段）三电泳、装柱（董、段）过柱纯化（董、段）四电泳检测、小结（董、段）动物操作练习（袁、杨）五荷瘤昆明小鼠模型的建立（袁、杨）六日第二周一细胞培养技术讲解（沈、吴）转染实验（沈、吴）二加血清（沈、吴）细胞培养技术讲解（沈、吴）三细胞换液、MTT法原理讲解（沈、吴）流式细胞技术讲解（沈、吴）四MTT法和AnnexinV/PI法的细胞接种（沈、吴）流式细胞技术检测TCRVβ7.1的表达（卢）五MTT法检测淋巴细胞的杀肿瘤细胞能力（沈、吴）流式细胞技术检测肿瘤细胞的凋亡（沈、吴）六用经基因工程药物处理的PBLC处理动物膜型（袁、杨）日第三周一蛋白类基因工程药物发酵原理讲解（赵）实验准备（赵）二起始菌浓度及诱导时间对蛋白产物量的影响（赵）三培养温度对菌体生长及蛋白产物量的影响（赵）四起始pH值对蛋白产物量的影响（赵）五发酵过程还原糖含量的变化及补糖对发酵的影响（赵）六核酸药物TCRVβ7.1在荷瘤昆明小鼠体内的分布（示教）（袁、杨）日2二、目的和意义基因工程技术是生物学、医学、制药学以及相关专业最重要的课程之一，特别是对于生物制药专业的学生来说，基因工程技术是他们学习的核心内容之一，在本科阶段培养他们对这门课程的兴趣，使他们掌握基因工程基本的操作技能和方法，熟悉基因工程的操作流程，并对他们的动手能力和科学思维进行锻炼，对于他们今后的工作和进一步的学习具有非常重要的意义。本院是一个院所合一的单位，为了发挥以科研促教学的优势，同时为了使学生对基因工程在制药专业上的应用有一个更加全面的认识，我们选取了自己一部分的科研工作用于学生的基因工程综合性实验，其中涵盖了核酸类基因工程药物和蛋白多肽类基因工程药物的关键技术。本次综合实验按照从上游到下游的顺序分为数个单元，主要包括分子生物学技术、细胞生物学技术、实验动物技术、药剂与药代动力学技术以及蛋白发酵技术等。3三、课程介绍及课堂讨论第一部分：基因工程介绍一、基因工程技术概述基因工程制药：利用基因工程的手段生产药物。70年代基因工程诞生，1977年出现第一个重组的生长激素抑制因子，1982年基因重组产品——人胰岛素在美国问世，自20世纪80年代以来，仅美国、日本开发的生物新技术新药物便达200多种，大都是重组蛋白质药物和重组DNA药物。美国是现代生物技术的发源地，也是应用现代生物技术研制新型药物的第一个国家，多种新型药物首创于美国。现有的近1300多家生物制药技术公司，资本总额已超过400亿美元。基因工程药物大体分为：蛋白类药物（酶、细胞因子、激素、单抗等）、核酸类药物（基因治疗）基因工程制药的特点：方便、快捷、可工业化生产二、基因工程制药的流程1、核酸类基因工程制药的流程获得目的基因→插入载体→导入表达宿主→诱导表达→提取纯化目的蛋白→检测活性→动物实验→临床试验。2、蛋白多肽类基因工程制药的流程获得目的基因→插入载体→扩增后提取纯化质粒→导入特定细胞→检测活性→动物实验→临床实验。3、两者异同点测活：方法不一样，但目的一样。工艺：核酸药的制备一般来说较简单，给药方式：核酸药的给药方式较复杂三、基因工程技术中一些关键的技术核酸提取和纯化、逆转录、PCR、重组载体的构建、转化/转染、诱导表达、蛋白提取和纯化四、基因工程技术需要注意的一些问题1、目的基因的获取2、载体的选择原则43、表达系统的选用原则4、活性检测的方式方法五、与本次实验有关的实验内容介绍1、结合科研工作介绍当初的选题背景和研究思路肿瘤一直是困扰人类的一类重大疾病，对它的治疗一直是医生和科学家们重点研究的目标之一。研究发现，机体内发挥主要抗肿瘤作用的细胞是淋巴细胞，淋巴细胞通过体液免疫和细胞免疫两种方式发挥抗肿瘤作用，一般认为其中细胞免疫发挥着主要的抗肿瘤作用。目前寻找肿瘤特异抗原的工作进展不是很顺利，给肿瘤的诊断、治疗和研究其发病机理带来了很大的困难。我们从TCR负责识别抗原这一理论基础出发，应用基因优势取用方法，利用不同的肿瘤细胞刺激T细胞，检测TCR家族的表达谱变化，从而初步确定特异性识别不同肿瘤抗原的TCR分子家族，在我们的研究中发现，肿瘤患者的TCRVβ基因表达均有不同程度的减弱，即优势表达一个或少数几个TCRVβ亚家族，同时其它TCRVβ亚家族显著减少或完全缺如，即有受体偏移现象。如图：我们将与肝癌识别有关的可变区属于Vβ7家族的TCR基因转入淋巴细胞，然后将该种淋巴细胞同肝癌细胞共孵育，发现该TCR分子不仅具有识别肝癌细5胞的作用，还有激活T细胞并增强其杀伤能力的功能，如图：体内实验也显示转染了该TCR分子的淋巴细胞能够有效杀伤接种于SCID小鼠体内的人肝癌细胞。如图：肿瘤组织大体照片A对照组B单纯PBMC组CTCR转基因组TCR基因转染组HE染色，20×TCR基因转染组LCA染色，20×HE染色和免疫组化显示淋巴细胞浸润62、本次实验所要操作的具体内容介绍结合大家以前的基础，本次综合性实验主要包括以下主要内容：（1）核酸类基因工程药物部分a、提取和纯化携带Vβ7.1家族TCR基因的重组质粒；b、将纯化的质粒转染人淋巴细胞，然后利用流式细胞仪检测所转基因的表达情况；c、分别利用流式细胞仪和MTT法检测转基因淋巴细胞对肝癌细胞的体外杀伤情况；d、构建荷人肝癌细胞瘤昆明小鼠模型（考虑到学生人数较多和饲养条件的限制，用昆明小鼠代替SCID鼠）；e、将转基因淋巴细胞注射至荷瘤小鼠体内的癌旁组织，并检测其在荷瘤小鼠体内的分布；f、利用免疫组化检测所转TCR基因在小鼠体内的分布（因时间所限，将以前所做结果利用多媒体形式向学生展示、讲解）。（2）蛋白多肽类基因工程药物部分考虑到以前学生已经进行过基因扩增、重组、转化和克隆等相关实验，本次就以摸索发酵条件为主要内容，包括：a、起始菌浓度及诱导时间对表达产物的影响；b、培养温度对表达产物的影响；c、起始诱导pH值对表达产物的影响；d、通气量对表达产物的影响；e、还原糖含量和补糖对表达产物的影响。3、阐明本次实验所要达到的目的，帮助学生理解基因工程技术在制药上应用的。第二部分：课堂提问与讨论第三部分：学生复述自己对基因工程制药技术的理解小结7四、实验实施在实验实施的过程中，每个实验单元由一位主讲教师总体负责，每个单元的实验课开始前首先由主讲教师对实验原理、实验内容、操作要点等进行详细的讲解，点明需要特别注意的地方，并承上启下地点明本次实验在整个综合实验中的位置，这样的集体授课保证了学生知识的统一性。在实验的具体实施过程中，学生分组进行操作，每个组由一位带教老师具体负责，针对学生实验过程中出现的各种问题进行及时的纠正和指导，回答学生的提问，并负责组织学生对实验结果进行讨论，这样不仅可以保证学生能够得到及时、正确的指导，同时也加深了学生们对实验内容的理解和掌握，对于提高他们的操作技能、锻炼他们分析问题解决问题的能力都很有帮助。在实验过程中，除了保证实验整体流程的完整性和一致性，我们还在不同小组间安排了一些差异化的实验内容。比如，在重组蛋白发酵条件优化实验中，我们安排不同的小组分别对构建在不同载体上的两个重组蛋白进行发酵条件的摸索，这无形中在学生们中间形成了一种竞争，每个小组都争取把自己的结果做得更好，更能说明问题，这样就需要整个组的成员相互协作、共同努力，通过这样的实验，学生的团队精神得到了培养。不仅如此，我们还将每个组细分为五对搭档，将要优化的几个发酵条件，如，起始诱导OD浓度、诱导时间、诱导温度、还原糖含量、通氧状况等分别交由每组不同的搭档组合轮流负责，其他同学为他们做一些辅助工作，这又更进一步地培养了学生的相互合作精神。通过这样的实验，我们希望学生不仅能学到专业知识也能够学到团队合作精神，这对于他们今后的工作和学习都是很有好处的。实验讲义见附录一。8五、实验考核在大实验结束之后，为了检验学生对实验内容的掌握情况，我们组织学生开展了一次知识竞赛，竞赛要考察的内容就是一些关于基因工程的重要的基础知识和试验操作中需要注意的一些重要环节。通过这种生动活泼的形式，有力地激发了学生们的学习兴趣，同时使他们的知识和技能在不知不觉中得到了进一步的巩固和提高。另外，为了锻炼学生的写作能力，并使他们对这次的综合性实验进行进一步的总结和提炼，我们要求学生按照学术论文的格式撰写实验报告，全文包括摘要、前言、材料与方法、结果与讨论等几部分。我们从科学期刊中选取例文给学生们详细讲解了撰写科技论文时要注意的一些问题。通过这样的模拟训练，我们希望能够使学生更多地了解关于科研工作的一些东西，次外，这样的写作经历对于学生今后毕业论文的写作以及进一步的学习与深造也是很好的锻炼。知识竞赛的内容见附录二。学生实验报告范例见附录三。9六、附录附录一：实验讲义（一）质粒pCDNA3.1-TCRVβ7.1的提取和纯化实验目的：利用层析技术分离质粒DNA实验原理：经过碱裂解制备的质粒DNA，还含有基因组DNA、RNA以及蛋白质的污染，纯度不是很高，不能满足后续的实验操作。常见对质粒DNA进一步纯化的方法包括酚/氯仿、CsCL密度梯度离心、离子交换层析等。在pH8.0条件下，质粒DNA带负电荷，且电荷数目与基因组DNA、RNA等存在一定的差异，因此，可利用该性质，通过离子交换层析，将其分开。所用试剂：LB培养基（300ml）：称取胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl10g，置于500ml三角瓶中，加H2O至300ml，用NaOH调pH至7.0，于121℃灭菌20min，冷却后备用[临用前按1:500倍体积加入卡拉霉素溶液(10mg/ml)]质粒提取试剂：300ml溶液I：50mM葡萄糖、25mMTris-HCl，pH8.0,10mMEDTA100ml溶液II：0.2MNaOH，1%SDS(新鲜配置)100ml溶液III：5M乙酸钾60ml、冰乙酸11.5ml、水28.5mlDEAE-sepharose层析试剂：300mlBufferA：0.1MTris-HCl，pH8.0200mlBufferB：0.1MTris-HCl，pH8.0，1MNaClDEAE-SepharoseFF每组20ml填料纯水50ml2MNaCl溶液10实验流程图操作步骤放大培养离心收菌洗涤沉淀重悬沉淀碱裂解菌体3ml菌种接种于300mlLB卡那抗性培养基中，37℃，250rpm，培养～3hr；将振荡培养的菌液转入离心管中于4℃，6000rpm，离心10min，弃上清；以5ml溶液I重悬沉淀，然后于6000rpm离心10min，弃上清，再依次重复两次；加入5ml溶液I重悬沉淀，室温放置10min；中和、复性沉淀质粒洗涤沉淀加入10ml溶液II后，迅速颠倒离心管4－6次；加入7.5ml溶液III，轻柔但彻底颠倒离心管4－6次，冰浴10min；然后于12000g，离心10mi