植物线粒体基因组序列与进化研究

植物线粒体基因组序列及进化研究华金平中国农业大学Tel:010-62734748(O)13141333576E-mail:[e-mail]2012.03.30一、研究背景•1.线粒体的起源假说•2.线粒体(mitochondria)•3.植物线粒体基因组结构、组成及功能•4.高等植物线粒体基因组•5.植物线粒体与细胞质雄性不育(CMS)•6.棉花线粒体基因组研究1.线粒体的起源¾线粒体基因组的起源假说：基因组比较分析，现存生物物种中的α-Proteobacteria与线粒体有着最近的亲缘关系。ItsmainfunctionistheconversionofpotentialenergyofpyruvatemoleculesintoATP.2.线粒体的结构线粒体-线粒体DNA-呼吸代谢及氧化磷酸化Fig1Thestructureandinteractionofthefivecomplexinmitochondria.3.植物线粒体基因组¾植物线粒体基因组的结构1.植物线粒体基因组主要是以环状分子形式存在2.重复序列介导可导致线粒体多元结构的产生(Sugiyamaetal.,2007；Yasunarietal.,2005；AlversonAJetal,2011)¾植物线粒体基因组的组成主要包括五类复合体酶系、细胞色素C合成酶系、核糖体大小亚基、rRNA和tRNA以及其他相关基因¾植物线粒体基因组的功能活细胞有氧呼吸的主要场所，主要参与电子传递及氧化磷酸化过程，还与细胞质遗传、信号转导及细胞凋亡等相关Fig2PCRstrategyfordetectingintra-molecularrecombinationacrossmitochondrialrepeats.4.高等植物线粒体基因组目前，植物界已测序线粒体基因组达到47个（引自NCBI）SpeciesLength（nt）GCContent(%)Codingsequence(%)TopologyGenesEncodinggenesStructureRNAsCompletedtimeArabidopsisthaliana366,9244418circular4925241997.01Betavulgarisssp.vulgaris368,8014321circular5524312000.07Brassicanapus221,8534522circular5131202006.08Nicotianatabacum430,5974418circular6638272005.01Caricapapaya476,890457circular5937222009.02Citrulluslanatus379,236458circular6339212010.04Cucurbitapepo982,833423circular5639162010.04Vitisvinifera773,279446circular13144342008.10Oryzasativassp.indica491,515439circular7432392006.03Oryzasativassp.japonica490,520439linear6332252008.075.植物线粒体基因组与CMS•细胞质雄性不育（Cytoplasmicmalesterility，CMS）在植物中普遍存在，其与线粒体DNA的重排和一些基因的特异性表达有关。据Kaul统计，在43个科162个属320种植物中发现617例天然的或种属间杂交来源的雄性不育。•线粒体DNA（mtDNA）是CMS因子的载体•植物线粒体基因组的突变、重组与重排、RNA编辑以及嵌合ORF等都可能是导致CMS的原因•不同的不育系其败育机理不同9植物败育机理•重复序列重组后产生的嵌合基因：如玉米T-urf13(Deweyetal.,1987)、小麦的orf256(Durocetal.,2005)、水稻CMS-BT的orf79(Wangetal.,2006)•与ATP合成酶亚基atp4、atp6、atp8、atp9编码序列嵌合的基因：芸苔属、萝卜及向日葵中atp8；玉米S型、高粱、矮牵牛中atp9；红莲型水稻中atp6存在差异。•与细胞色素氧化酶亚基序列嵌合的基因。cox2是矮牵牛pcf基因的一部分；水稻(Bo型)、小麦、玉米(S型)CMS与cox1相关。•独立未确认的嵌合序列：如菜豆的pvs序列•RNA编辑•突变、远缘杂交、种间核质基因组交换等Fig3ChimericGenesAssociatedwithCMSHansonandBentolila,20049CMS分子机制•(1)线粒体基因组新的嵌合阅读框与其邻近的保守基因共转录，造成保守基因的单顺反子转录本减少，从而减少保守基因编码的蛋白质，致使植物某些功能异常或者缺失而发生不育；•(2)新的嵌合阅读框编码一种毒蛋白质，该蛋白质干扰保守基因的生物活性或者干扰花药发育的生理生化过程、中断花粉发育。9恢复基因的克隆•己克隆玉米Rf2基因、矮牵牛Rf基因、水稻Rf-1基因、萝卜Rf0基因•除了玉米Rf2是编码线粒体定位的乙醛脱氢酶（aldehydedehydrogeaes，ALDH）(Liuetal.，2001)之外，其余的恢复基因均含有PPR蛋白•大多数植物核恢复基因不影响线粒体的一级结构，主要调控作用发生在转录或转录后水平，而菜豆（Phaseolusvulgaris）核恢复基因Fr则直接影响CMS系线粒体基因组的结构-通过选择性消除与CMS相关的pvs序列而使育性恢复（Schnable,1998）6.棉花线粒体基因组的研究•棉属分4个亚属、8个组、9个亚组，现有50个种•获得的异源细胞质系不多于15个，其中，仅在哈克尼西棉(G.harknessiiBrandegee)、亚洲棉(G.arboreumL.)、异常棉(G.anomalumWawra&Peyr.)、陆地棉和三裂棉(G.trilobum(DC.)Skov.)中有CMS的相关报道9PFGmarker对棉花mtDNA基因组大小预测图1.引自黄晋玲论文《棉花晋A的细胞质雄性不育系和保持系线粒体基因组文库的构建》图2.引自代培红论文《棉花线粒体基因组细菌人工染色体文库的构建》1989年，Mullin等用三种限制性酶HindIII,EcoRIandBamHI酶切分析陆地棉mtDNA的大小，分别预测为697，695，712kb(Huangetal.,2008)。9棉花CMS相关研究进展•棉花mtDNA提取方法酚类物质干扰、存在核及叶绿体基因组污染•构建了棉花线粒体基因组BAC文库(Daietal.,2007)¾1996年，刘少林等采用RAPD技术对棉花CMS三系线粒体基因组和叶绿体基因组的差异进行了分析，认为棉花CMS性主要与线粒体异常有关。¾2000年，王学德以哈克尼西棉CMS系和保持系的花药及黄化苗为材料，分别对线粒体蛋白质和进行了SDS-PAGE、RAPD和RFLP分析，发现处于败育时期的不育系花药线粒体内缺少一种约的31kDa的多肤；RFLP分析发现，不育系比保持系线粒体缺少一个大小为1.9kb的与cox2基因具有同源序列的片段。¾2003年，黄晋玲用6个线粒体基因组探针对晋A胞质不育系和保持系mtDNA进行RFLP分析，发现atp6和cox2基因在两者中的杂交带型不一致，与保持系相比atp6和cox2基因在晋A不育系中分别缺少5.7kb和4.2kb的强杂交带。¾2010年，张金发通过RFLP分子标记技术，用cox1,cox2,atp1三个线粒体基因作为探针检测多态性，最显著的是三种酶切后cox2探针在陆地棉CMS-D2较保持系都多出1条片段，可能为其中CMS基因所在区域。¾2010年，邢朝柱以哈克尼西棉CMS系和保持系为材料，得到扩增片段大小存在差异的atpA基因及其侧翼序列；RACE方法获得atpA基因cDNA全长测序后发现，不育系为1582bp，保持性为1566bp，两者预测的编码蛋白质不同，认为这可能是导致CMS的原因。¾证明棉花CMS系和保持系在线粒体DNA水平上存在差异——在棉花CMS线粒体基因组内还没有找到与不育相关的、类似其它植物的由不同基因嵌合形成的开放阅读框。¾棉花CMS机理？9陆地棉育性恢复相关研究•分子标记研究发现，CMS-D2-2育性恢复基因Rf1能够恢复CMS-D2-2和CMS-D8，但是CMS-D8育性恢复基因Rf2只能恢复CMS-D8，二者以相斥相紧密连锁，遗传图距0.93cM(Zhang和Stewart，2001a；2001b)二、研究目的与技术路线•陆地棉线粒体基因组的分化完成棉花线粒体基因组的组装和基因组注释，了解棉花线粒体基因组的结构、功能和进化特征•棉花CMS不育形成机理育性恢复形成代谢途径的分子机制技术路线功能基因注释、tRNA、rRNA预测等完成棉花线粒体基因组finish图谱基因组结构分析、RNA-editing、repeats、进化和CMS等黄化苗提取mtDNA构建Fosmid文库设计特异引物筛选文库Solexa测序数据分析，拼接提取mtRNAcDNA补洞构建单克隆重叠群三系CMS相关基因的筛选cDNARFLP获得目的基因完整ORF目的基因DNA、RNA、蛋白水平分析目的基因验证（转化拟南芥、烟草、棉花）RNA编辑分析材料：哈克尼西棉不育系、保持系和恢复系9绘制完整图谱。1.摸索棉花线粒体分离和线粒体DNA提取技术2.高通量测序线粒体基因组3.构建线粒体基因组Fosmid文库4.筛选文库5.完成线粒体基因组图谱——基因组结构、基因、repeats、重组重排、进化等分析9比较基因组分析，克隆哈克尼西棉不育相关基因。9功能验证，不育机理研究。三、研究进展•1.线粒体DNA的提取•2.线粒体基因组文库的构建与筛选•3.线粒体DNA的测序(454测序和Solexa测序)及数据分析、补洞•4.高等植物线粒体基因组进化初步分析1、线粒体DNA提取N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12mt13mt14cp15cp16cp17cp18D:细胞核、叶绿体以及线粒体特异引物扩增mtDNAN1~N12：核基因引物；mt13~mt14：线粒体引物；cp16~cp18：叶绿体引物N1N2N3N4N5N6N7N8N9N10N11N12mt13mt14cp15cp16cp17cp18ABCA:棉花黄化苗；B:Mitotracker活体染色线粒体后电镜观察；C:电泳检测线粒体DNA2.线粒体基因组文库的构建与筛选¾哈克尼西棉不育系(2074A)、保持系(2074B)、恢复系(E5903)、陆地棉不育系(2074S)以及海岛棉pima90-53线粒体基因组Fosmid文库的构建¾每个文库挑取覆盖线粒体基因组50多倍的单克隆，保证棉花线粒体基因组每个位点的覆盖度达到99.9%，并构建混合池用于筛库。¾线粒体基因组文库的筛选根据功能基因保守性设计筛选标记，共37个标记，主要包括9NADH脱氢酶系(nad1、nad2、nad3、nad4、nad4L、nad5、nad6、nad7、nad9)9琥珀酸盐脱氢酶系(sdh3、sdh4)9细胞色素b前体(cob)9细胞色素c氧化酶系(cox1、cox2、cox3)9ATP合成酶系(atp1、atp4、atp6、atp8、atp9)9核糖体蛋白大小亚基(rpl2、rpl5、rpl16、rps3、rps4、rps7、rps10、rps14)9细胞色素C合成酶系(ccmB，ccmC，ccmFc，ccmFn)9rRNAs(rrn5、rrn18，rrn26)9其他基因(mttB、matR)¾海岛棉线粒体基因组BAC文库河北农大构建的陆地棉品种pima90-53的基因组BAC文库注：叶绿体psbA基因为探针，与海岛棉Pima90-53的BAC文库中的8848个克隆杂交，结果表明约0.2%的克隆含有与细胞器基因组DNA同源的序列。棉花品种单克隆数覆盖基因组倍数平均插入片段空载