第七章-器官发生与体细胞胚胎发生

湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日第七章器官发生与体细胞胚胎发生植物细胞全能性实现的过程:外植体脱分化愈伤组织再分化不定芽胚状体丛芽生根发育成完整的植株发育成完整的植株湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日脱分化:成熟细胞转变成分生状态并形成愈伤组织的过程.再分化:由分生状态的愈伤组织或外植体分化出各种器官的过程.湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日器官发生概念：离体培养的组织、细胞在诱导条件下经分裂和增殖再分化形成不定根和不定芽等器官的过程。发生方式：直接发生：（具有初生分生能力的）外植体直接分化成器官的过程。如落地生根.间接发生：外植体（已分化的成熟组织）经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日组织的分化与器官建成维管组织的分化早期研究发现（Wetmore，1955），丁香的芽可以诱导邻近的组织分化出维管束，后证明这是芽中IAA的作用。将一块含有14C-IAA和蔗糖的琼胶楔形物插入到愈伤组织切口中，14C-IAA表明蔗糖和IAA通过琼胶扩散到愈伤组织，从而在愈伤组织中造成这两种物质的梯度，在楔形物一颇有同感形成维管束的瘤状物，瘤状物含有一形成层带，一面形成韧皮部，一面形成木质部，与正常的维管束有类似的排列。增加IAA的浓度，导致木质部形成，增加蔗糖浓度则导致韧皮部形成。生长素水平恒定时，2%蔗糖则全部分化出木质部，4%蔗糖几乎全部分化出韧皮部，3%蔗糖则可以分化出二者。所以，生长素和蔗糖浓度决定愈伤组织中维管束的类型与数量。湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日组织的分化与器官建成Rier和Beslow进一步报道，蔗糖不仅影响细胞的数目，而且影响其结构。低浓度蔗糖（0.5%）诱导出环纹和梯纹管胞，1.5-3.-5%蔗糖诱导出梯纹和网纹细胞。细胞分裂素类对促进木质部形成也有作用。它们使碳水化合物代谢趋向于五碳糖途径，促进木素前体苯丙烷的合成，不同的细胞分裂素作用不同。玉米素激动素6-BA（6-苄基腺嘌呤），NAA/激动素的比值为0.5/20时有木质部发生和根形成，而比值降为0.025/0.4时，只发生木质部而不发生根，赤霉素（GA）、乙烯、脱落酸对木质部发生有抑制作用。湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日组织的分化与器官建成根和芽的分化外植体诱导出愈伤组织后，经过继代培养，可以在愈伤组织内部形成一类分生组织（meristemoid）即具有分生能较往年小细胞团，然后，再分化成不同的器官原基。有些情况下，外植体不经愈伤组织而直接诱导出芽、根。所以器官发生有两种方式，即直接和间接的。外植体→器官发生（根、芽或胚状体）→再生植株。外植体→愈伤组织→类分生组织→根、芽→再生植株。湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日组织的分化与器官建成根是组织培养中易形成的器官，早在30年代，就看以胡萝卜培养物中根的形成，以后又在多种植物中看到，同一植物不同器官可以诱导出根来：如棉花幼苗子叶、下胚轴切段、油菜叶片、叶柄、下胚轴等，多种植物愈伤组织也易生根。湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日组织的分化与器官建成形成芽的培养基条件常有不同，有时芽与根可以同时在组织培养中形成，一般说，培养物中形成的芽如胡萝卜悬浮培养，油菜愈伤组织等。在组织培养中通过根、芽诱导再生植株方式有三种：一种在芽产生之后，于芽形成的基部长根而形成小植株，一种是在根上生长出芽来，另一种即在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后两者结合起来形成一株植物。湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日组织的分化与器官建成除营养芽之外，在组织培养中有时也有花芽的形成，如烟草、花生等。也有变态器官的形成，如百合鳞片切块分化出的芽，形成小鳞茎，唐菖蒲茎端可诱导形成小球茎，马铃薯的茎切段可以形成块茎。湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日组织的分化与器官建成植物激素的成分影响着器官建成，Skoog和Miller等所提出的生长素和激动素比例决定根和芽分化的观点，曾被大量的试验结果所证明。在很多禾谷类作物的组织培养中发现，用较高浓度的生长素（2，4-D）诱导形成的愈伤组织，当培养在除去生长素，或适当浓度的活性较低的生长素中时，就可以诱导芽的形成。Nitsch等用Linsmaier(LM)培养基附加10-5摩尔2，4-D培养水稻愈伤组织可以生根，一旦转入无生长素的培养基时就能产生芽。Rangan将小米愈伤组织从含生长素的培养基转移到无生长素的培养基，一个星期内就形成了芽。湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日组织的分化与器官建成但在另一些例子中激素比例控制器官分化的问题则出现完全相反的情况。苜蓿在有2，4-D和细胞分裂素的培养基中，可以形成愈伤组织，转入不加以上两种激素的培养基中能分化，但分化的情况与原来的激素比例有关。如果愈伤组织是在高细胞分裂素/生长素比例的培养基中形成的，易于生根，而在高生长素/细胞分裂素比例的培养基中形成的，易于生根，而在高生长素/细胞分裂素比例的培养基中形成的愈伤组织，则易生芽。湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日组织的分化与器官建成由此看来，分化与激素的关系同植物的遗传性有着密切的关系，用五个品种的烟草做实验，用相同的生长素/细胞分裂素比例，结果有的品种形成很多芽，有的形成很少芽，有的完全不生芽。湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日组织的分化与器官建成培养基的物理因素和外界条件对器官建成有一定影响。固体培养基有利于诱导愈伤组织，而液体培养基有利于细胞和胚状体增殖。蓝光有利于芽的分化，而红光、远红光对芽分化有抑制作用，但促进根分化，紫光对生芽有刺激作用。石刁柏、虎耳草属、凤梨科植物分化前期需要低光强（1000勒克斯），后期要求高光强（3000-10000勒克斯），降低氧浓度促进胡萝卜愈伤组织芽的形成，增加氧浓度促进不定根形成。湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段：外植体细胞脱分化。外植体发生细胞分裂，或进而形成愈伤组织。这一阶段同不定芽方式一样。胚状体形成在植物有性生殖中，精于和卵子结合形成合子，合子进一步发育成胚。但在组织培养条件下胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。胚状体再发育成完整植株在外观上，这种方式和不定芽均有光滑、圆形突起的形状。胚状体方式(somaticembryo)湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日胚状体方式(somaticembryo)湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日胚状体与不定芽的区别胚状体在组织学上具备以下和不定芽不同的三个特征：最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不定芽的维管组织无此现象。胚状体也是植物组织培养形态发生最常见而重要的方式，它较不定芽方式有更多的优点：如胚状体产生伪数量比不定芽多；胚状体可制成人工种子，便于运输和保存；胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。这些对组织培养应用于育种是十分有利而重要的。湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日胚状体与合子胚的比较合子胚胚状体质量萌发率高，质量好萌发率低，质量差来源受精卵体细胞胚柄有，明显即使有也不明显形态固定，体积相对较小复杂，常有两个以上的子叶体积相对较大变异率低高湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日生长素类：以离体培养条件下胡萝卜的体细胞胚胎发生的诱导过程来进行分析（教程P99），在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养（增殖培养基），通常所用的生长素是2，4-D，浓度范围0.5—1mg/L。在这样一种培养上，愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团，称作“胚性细胞团”。在增殖培养基上反复继代，胚性细胞团的数量不断增加，但并不出现成熟的胚。影响体细胞胚胎发生的因素——生长调节物质湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日然而，如果把胚性细胞团转移到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养（成胚培养基）上，它们就能发育为成熟的胚。看来，在增殖培养基中生长素的存在，对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少的。边疆保存在无生长素培养基中的愈伤组织不能形成胚。在这个意义上，可把增殖培养基看成是体细胞胚胎发生的：诱导培养基：，而把每个胚性细胞团看成是一个无结构的胚。影响体细胞胚胎发生的因素——生长调节物质湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日细胞分裂素类：细胞分裂素对于体细胞胚胎发生的作用有相反的结论，既或促进也可抑制体细胞胚的发生，这主要取决于植物的种类及其基因型。一般而言，细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显著作用，特别有利于子叶的发育。另外有研究表明，不同的外植体对于细胞分裂素的需要可能具有不同的专一性，如在胡萝卜的研究中发现，虽然BAP和激动素对胚胎发生过程表现抑制作用，但浓度为0.1μmol/L的玉米素却能促进这个过程，而BA对胡萝卜则是促进其愈伤组织的增殖，但不形成胚性愈伤组织。影响体细胞胚胎发生的因素——生长调节物质湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日赤霉素类：赤霉素类能抑制体细胞胚胎发生，但对于许多植物而言，赤霉素对于体细胞胚胎的成熟与萌发有促进作用。影响体细胞胚胎发生的因素——生长调节物质湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日脱落酸：抑制剂特别是ABA，在体细胞胚胎发生过程中的作用正逐渐被提示出来，ABA是一种天然产生的生长调节剂，当把无抑制作用剂量（通常是0.1—1μM）的ABA用于荷兰芹属培养物时，可以允许胚成熟过程进行。但是其抑制异常增殖，包括不定胚的启动。另一方面抑制早熟萌发。影响体细胞胚胎发生的因素——生长调节物质湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日氮源的形态有还原态氮（NH4+）和氧化态氮（NO3—）两种。在以KNO3为唯一氮源（如White培养基）的培养上建立起来的愈伤组织，去掉生长素以后不能形成胚。然而是，若在培养基中加入少量NH4Cl即可明显促进胚状体的发育，上述结论是否说明，胚胎发生过程中还原态氮是必需的？我们可以对以下的实验进行分析。影响体细胞胚胎发生的因素——氮源湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日Reinert及基合作者在栽培胡萝卜愈伤组织培养中(培养基均为White培养基)得到以下结果：NH4+氮（M）NO-3氮（M）体胚发生数（个/2ml）10401131±21905519±0.309511.3±4.1从上表可以分析得出，尽管高浓度的氧化态氮同样可以诱导体细胞胚胎发生，但是其诱导率远远低于还原态氮和氧化态氮配合使用时的诱导率。影响体细胞胚胎发生的因素——氮源湖北生态工程职业技术学院生物工程系2019年10月25日有些愈伤组织或悬浮培养物起初具有器官发生或胚胎发生的潜力，但经过反复继代保存之后喧种形态发生能力常常逐渐下降，有些甚至