发酵工程及下游技术实验指导

发酵工程及下游技术实验指导（第一版）主编咸洪泉李树文编写人员咸洪泉李树文郭立忠李雅华青岛农业大学出版社前言发酵工程是利用生物，特别是微生物的特定性状和功能，通过现代化工程技术来生产有用物质或将生物直接用于工业化生产的技术体系，是利用生物材料服务于人类的一门综合性科学技术，也是连接生命科学研究和应用的桥梁。掌握发酵工程的基本理论知识，熟悉操作发酵工程的工艺流程和实验技术对于有志于从事本学科研究的学生来说尤为重要。本实验指导本着培养学生的创造性、自主性，提高学生发现问题、分析问题和解决问题的能力的角度而编写，希望能够满足生物技术、生物科学专业教学的需要，同时也希望对热爱本学科的读者能有所裨益。本实验指导的内容包括发酵和提纯两大部分，发酵部分包括发酵培养基设计、发酵罐操作、发酵工艺条件优化以及动力学曲线等实验内容，提纯部分包括盐析、有机溶剂沉淀、分子筛层析、有机溶剂萃取、膜分离技术、离子交换等实验内容，本书注重理论与实际相结合，以应用性为主，理论为辅，在操作过程中体会实际的应用，为进一步提高学生的动手能力和综合素质提供了良好的实验教材。本书由咸洪泉副教授、李树文讲师、郭立忠教授和李雅华高级实验师编写，其中实验一至实验十五主要由咸洪泉副教授编写，实验十六至实验二十二主要由李树文讲师编写。本书的编写得到了生命科学学院领导、青岛农业大学教务处和出版社的深切关怀和指导，在此表示衷心感谢。由于编者水平所限，错误和不足之处，恳请读者不吝赐教，以便今后进一步修正提高。编者2008.8目录实验一从土壤中分离、纯化筛选产酶菌株..............................1实验二诱变育种....................................................4实验三菌种保藏技术................................................8实验四液体发酵培养基的设计.......................................20实验五生产菌株发酵条件的优化.....................................23实验六生长曲线和产物形成曲线的测定...............................27实验七发酵动力学曲线的绘制.......................................30实验八机械搅拌通风发酵罐的结构和基本操作技术.....................35实验九小型发酵罐分批发酵.........................................49实验十中试发酵设备的使用方法.....................................53实验十一气升式生化反应器的使用...................................56实验十二摇床溶氧系数的测定.......................................59实验十三酸乳的制作...............................................61实验十四甜酒酿的制作.............................................63实验十五葡萄酒的制作.............................................65实验十六盐析沉淀法...............................................67实验十七有机溶剂沉淀法...........................................75实验十八膜分离技术...............................................80实验十九单级溶媒萃取.............................................86实验二十分子筛层析...............................................93实验二十一离子交换树脂法.........................................97实验二十二糖化酶的发酵和提取实验...............................100主要参考文献.....................................................1051实验一从土壤中分离、纯化筛选产酶菌株一、实验目的1．根据一定的生产目的如抗生素或酶类的生产，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如土壤中筛选出高产菌株。2．加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。二、基本原理从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。平板分离法是常用的方法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。其基本原理包括两方面:(1)选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等条件，或加入某种底物、抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。(2)微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养，获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。土壤是微生物生活的大本营，它所含微生物无论是数量还是种类都是极其丰富的。因此土壤是微生物多样性的重要场所，是发掘微生物资源的重要基地，可以从中分离、纯化得到许多有价值的菌株。本实验将采用酪素培养基从土壤中分离产蛋白酶的微生物。三、实验材料1.土样2.酪素琼脂培养基：Na2HPO4.7H2O1.07g,KH2PO40.36g,干酪素4g,琼脂20g,1%酪2素水解液0.3mL,水1000mL。3.溶液或试剂盛9mL无菌水的试管，盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶4.仪器或其他用具无菌玻璃涂棒，无菌吸管（或移液枪），接种环，无菌培养皿，显微镜，血球计数板等。四、实验步骤1.稀释涂布平板法倒平板将酪素琼脂培养基加热溶化,待冷至55-60℃时，倒平板。2.制备土壤稀释液称取土样lOg,放入盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合，将细胞分散。用一支1mL无菌吸管从中吸取lmL土壤悬液加入盛有9mL无菌水的大试管中充分混刀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1mL加入另一盛有9mL无菌水的试管中，混合均刀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、l0-4、10-5、10-6不同稀释度的土壤溶液。3.涂布将倒好培养基的三个平板底面分别用记号笔写上10-4、10-5和10-6三种稀释度，然后用无菌吸管分别由10-4、10-5和10-6三管土壤稀释液中各吸取0.lmL对号放入已写好稀释度的平板中,用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均刀，室温下静置5-10min,使菌液吸附进培养基。平板涂布方法：将0.lmL菌悬液小心地滴在平板培养基表面中央位置(0.1mL的菌液要全部滴在培养基上，若吸移管尖端有剩余的菌悬液，可将吸移管在培养基表面上轻轻地按一下便可)。右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均刀,然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次。4.将酪素琼脂平板倒置，于28℃下培养，直至长出菌落。5.挑取菌落周围出现透明圈的单菌落，采用平板划线法纯化，并将纯化的菌株接种于斜面保存。6.纯化的菌株分别接种到酪素琼脂上，根据菌落周围出现透明圈大小筛选出产酶能力强的菌株。五、思考题1.你所做的涂布平板法是否较好地得到了单菌落?如何确定平板上某单个菌落是否3为纯培养?2.如果一项科学研究内容需从自然界中筛选到能产淀粉酶的菌株，你将如何完成?请写出简明的实验方案(提示：产淀粉酶菌株在淀粉培养基上可降解淀粉，产淀粉酶菌株菌落周围淀粉被降解，遇碘不再变蓝故形成透明圈)。淀粉培养基：蛋白胨10g，NaCl5g,牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸馏水1L，琼脂15-20g，121℃灭菌20mim。4实验二诱变育种一、实验目的通过实验，观察紫外线、硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应，并学习理化诱变育种的方法。二、基本原理许多物理因素(如紫外线、X射线，Y射线等)和化学因素(如硫酸二乙酯、氮芥、亚硝酸、乙烯亚胺、亚硝基胍等)对微生物都有诱变作用。能够引起诱变作用的这些理化因素称为诱变剂。诱变剂的作用是使菌体内遗传物质，主要是DNA的分子结构发生改变，从而引起菌体遗传性变异。本实验以紫外线和硫酸二乙酯单因子作为诱变剂分别处理产生淀粉酶的枯草芽孢杆菌BF7658为例，根据枯草芽孢杆菌BF7658诱变后在淀粉培养基上透明圈直径的大小，来指示诱变效应。一般透明圈越大，淀粉酶活性越强。三、实验材料1.菌种枯草芽孢杆菌BF7658。2.试剂淀粉培养基，0.1mol/pH7.0的磷酸缓冲液，硫酸二乙酯(简写DES)，碘液，无菌生理盐水。3.仪器1mL吸管，盛4.5mL无菌水的试管，玻璃刮棒，血球计数板，显微镜，紫外线灯(15w)，电磁搅拌器，离心机，盛玻璃珠的三角烧瓶等。四、实验步骤1.紫外线对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应（1）菌悬液的制备a．取培养48小时的枯草芽孢杆菌BF7658的斜面4—5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。b．将上述菌液离心(3000r／min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2－3次，昀后制成菌悬液。c．用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。（2）平板制作将淀粉琼脂培养基溶化后，冷至45℃左右时倒平板27套，凝固后待用。（3）紫外线处理a．将紫外线灯开关打开预热约20分钟。B．取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5mL，并放入无菌搅拌棒于平皿中。c．将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm、功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟、3分钟及5分钟。(4)稀释在红光灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1—10-6(具体可按估计的存活率进行稀释)。(5)涂平板取10-3、10-4、10-5三个稀释度涂平板。每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1mL，用无菌玻璃棒涂刀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。(6)培养将上述涂刀的平板，用黑布(或黑纸)包好，置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。(7)计数将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。(8)观察诱变效应平板菌落计数后，分别向菌落数在5—6个左右的平板加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径，并计算其比值(HC值)。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。2.硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应(1)菌悬液制备a．将枯草芽孢杆菌BF7658接一环到装有30mL淀粉培养液中，置37℃振荡培养14小56时左右(对数生长期)。b．取上述培养物10mL进行离心(3000r／min离心15分钟)，弃去上清液，将沉淀下来的菌体再用0.1mol／LpH7.0的磷酸缓冲液洗涤2—3次,昀后用原体积的磷酸缓冲液制成菌悬液。c．用显微镜直接计数法，调节细菌数每毫升约为108个。(2)