讲座-抗氧化研究方法

29October20191民族药化学研究之-抗氧化与民族药第一节自由基与氧化损伤第二节化学与抗氧化研究第三节民族药与抗氧化研究29October20192万病之源几乎所有的疾病和自由基有关。诸如癌、中风、高血压、心脏病、糖尿病、气喘、白内障、肺气肿、胰脏炎、肠炎、消化性溃疡、风湿性关节炎、老人失智症以及帕金森氏症等一百多种。29October20193自由基生物学效应举例1.遗传物质损伤、突变、增殖……肿瘤；2.细胞通透性改变、死亡……衰老；3.大分子交联……脂褐质（老年斑）；4.低密度脂蛋白氧化…吞噬细胞…泡沫细胞…斑块….动脉粥样硬化；疾病：肿瘤、动脉粥样硬化、中风、帕金氏病，白内障；29October20194第一节自由基与氧化损伤29October201951.1自由基及其形成1.1.1自由基及其性质1.1.2机体自由基的形成29October201961.1.1自由基及其性质自由基是独立存在的、含有一个或多个未成对电子的分子或原子团。化合通过异裂反应，成键的两个电子分给两种分裂产物之一，生成物为离子。均裂反应，两个电子均分给两个产物，其分裂物为自由基。A:BA++:B-A:BA·+B·29October20197机体中自由基的主要种类机体在代谢中不断产生的自由基，种类繁多，其中以活性氧最多，其次是脂类自由基。氧自由基(oxygenfreeradical,OFR)：由氧诱发的自由基。常见氧自由基有：超氧阴离子（O·-2），羟自由基（OH·）一（单）线态氧（1O2）脂类自由基：氧自由基与多价不饱和脂肪酸作用后生成的中间产物，常见脂类自由基有：烷自由基（L·），烷氧基（LO·），烷过氧基（LOO·）等。活性氧：含氧的高反应活性分子。重要的活性氧有：氧自由基+普通氧+过氧化氢29October20198（1）活性氧（1）超氧阴离子：有一个未成对电子，有顺磁性，既是氧化剂，又是还原剂，可引起脂质过氧化，寿命较长，可促进其他氧自由基的生成。（2）羟自由基：是已知最强的氧化剂，几乎能与所有的细胞成分进行抽氢、加成、电子转移等反应，反应速度极高。羟自由基寿命短，过渡金属对羟自由基生成有促进作用。（3）过氧化氢：过氧键不稳定，见光均裂成羟自由基。可由超氧阴离子自由基歧化生成，也可由酶促反应直接生成。过氧化氢通过生成羟自由基对细胞造成伤害。（4）单线态氧：是普通氧的激发态，无顺磁性，虽不是自由基，但反应活性高，可在自由基反应中生成。（5）普通氧：氧分子有顺磁性，是一种双自由基。基态氧反应活性较低。29October20199（2）脂性自由基氧自由基与多价不饱和脂肪酸作用后生成的中间产物种类：烷自由基（L·）烷氧基（LO·）烷过氧基（LOO·）3.其它:Cl·、CH3·、NO·29October201910自由基特点化学活性强，易参与氧化还原反应极不稳定，半衰期短10-3s；具有磁场，可利用电子自旋共振检测；自由基反应为连锁反应；（引发－延伸－终止）：29October2019111.2机体中自由基的形成正常代谢、生理过程非生物性29October201912机体为什么要产生自由基?（1）氧的代谢-电子传递链：氧气是维持生命存在不可缺少的物质，但氧在代谢过程中，也会带来“副产品”-自由基。生物体96-99％的氧分子经线粒体氧化还原为水，1～4%的氧由于单电子泄漏，形成O2－·、H2O2等活性氧。人每一次呼吸，都会产生数以千计的自由基。反应类型：酶催化反应。位于线粒体内膜的电子传递链，代谢物上的氢原子被脱氢酶激活脱落后，经过一系列的传递体，最后传递给被激活的氧原子，而生成水的全部体系29October201913O2+e→O2-O2+2e+2H+→H2O2O2+3e+3H+→·OH+H2OO2+4e+4H+→2H2O参与代谢的氧有4~5％的氧将被酶所催化形成超氧阴离子。在氧代谢过程中，二个氧原子，可以受从（电子传讯链）中传下来的四个电子，与氢离子结合形成水。但如果一个氧分子只接受到一个电子，即形成超氧阴离子自由基；若一个氧分子接受两个电子和两个氢离子，则形成过氧化氢；若一个氧分子接受三个电子，则形成为羟基自由基。29October201914自由基的性质-双刃剑(生理活性与毒性)1.自由基在机体生化反应中不断生成，机体对体内的自由基有一套完整的调控系统-自由基平衡。2.自由基具有高度的化学活泼性，极易与相邻的物质发生电子的得、失交换，参与生化反应，自由基是一把双刃剑-高度活泼性。3.具有顺磁性、半减期极短，一般仅能以μS计，作用半径短-顺磁性及短命。29October2019154.自由基参与许多生命活动中的生化反应，如氧化还原反应、光合作用等，在维持生命正常活动中起着重要作用-生理功能。5.当自由基生成的数量或时空定位出现异常，超出机体的调控能力时，自由基将造成组织的损伤，核酸、蛋白质、脂质等大分子物质最易受自由基破坏和攻击-氧化损伤。29October201916细胞溶质的羟基自由基的生成氧代谢产生的H2O2进一步单电子还原，生成羟自由基(OH·)，称之为Haber-Weiss反应。该反应速度很慢，很难由此生成OH·.此反应中在SOD酶和过渡金属离子如微量铁离子或铜离于的催化下才能达到较快的反应速度.由铁离子催化的此反应，叫Fenton型Haber-Weiss反应-著名的芬顿反顿.H2O2+Fe2+·OH-+OH-+Fe3+29October2019171.2氧化损伤1.2.1自由基与氧化损伤1.2.2机体自由基的形成29October2019181.2.1自由基与氧化损伤实际上所有的内源化合物都是毒物潜在的靶标，然而毒理学上相关的靶标是大分子，如核酸（特别是DNA）和蛋白质。在小分子中，膜脂质最为常见。29October201919自由基对机体的损伤1对核酸的损伤碱基修饰：→碱基降解多核苷酸链断裂，造成碱基降解、氢键破坏，产生遗传突变，严重的DNA损伤不能修复，导致细胞死亡。2对蛋白质的损伤直接作用于蛋白质：修饰氨基酸残基：构相变化，pr变性，酶失活对蛋白水解酶敏感性增强通过脂过氧化产物作用于蛋白质：使蛋白质分子间或与其它大分子交联29October201920脂质过氧化损害：脂质过氧化(lipidperoxidation)：指主要由自由基引起的多不饱和脂肪酸的氧化作用对生物膜具有强烈的破坏作用。1.自由基的形成与脂质过氧化的关系①启动阶段：脂质过氧化是由一些脂链侧链甲叉碳上除去一个氢的化合物所启动。OH·是最重要的脂质过氧化的诱导物。29October201921脂质过氧化损害：②发展阶段：已形成的自由基将作为启动子而产生新的自由基，使反应发展下去。在发展阶段中，形成的自由基总数保持不变，一种自由基团可经多种反应转变成另一种形式的自由基团。去氢后的碳原子形成中心自由基(L·)。与脂质过氧化反应关系最重要的是脂质过氧化自由基和脂质过氧化物的形成。③终止阶段：只有二个自由基相互作用，才能使自由基反应链终止，消除自由基。29October201922脂质过氧化的后果：①细胞器和细胞膜结构的改变和功能障碍。②脂质过氧化物的分解产物具有细胞毒性，其中特别有害的是一些不饱和醛类。③对DNA影响：一是脂质过氧化自由基和烷基自由基可引起DNA碱基，特别是鸟嘌呤碱基的氧化；一是脂质过氧化物的分解产物，丙二醛可以共价结合方式导致DNA链断裂和交联。④对低密度脂蛋白(LDL)的作用。29October201923自由基氧化损伤与机体衰老质膜脂质过氧化→膜功能紊乱→细胞代谢障碍→加速细胞衰老DNA损伤→基因突变→Pr、酶合成错误，酶活降低以上等结果的积累导致器官组织细胞的老化与死亡自由基作用免疫系统，引起细胞、体液免疫功能减弱，加速老化29October201924近30年来，自由基在生物学和医学领域中的研究取得了一些重要的进展和突破，自由基在肿瘤、辐射损伤、老化和某些疾病（白内障、糖尿病、精神病、肺气肿、炎症和缺血性疾病）发生发展中的作用得到了进一步的证实。29October201925自由基氧化损伤与疾病自由基与心血管疾病自由基与癌症自由基与肺气肿自由基与缺血后再灌注损伤自由基与眼病自由基与炎症自由基与贫血29October201926氧自由基对人类的影响自由基与疾病自由基与免疫自由基与衰老自由基与营养29October201927研究发现机体中的一些过渡金属能加剧自由基反应的进行，从而表现出一定的毒性。Fe2+、Cu+参与Fenton反应；Pb2+、Co2+、Hg2+、Ni2+、Mo3+、Cd2+可增加细胞的脂质过氧化，并进一步损伤组织。另外，其它金属对环境的污染及和自由基的关系也有一些报导。29October201928第二节化学与抗氧化研究2.1自由基的发生与检测2.2氧化损伤的检测29October2019292.2自由基发生与检测实验模型2.2.1自由基发生体系2.2.2自由基的检测2.23自由基的清除试验29October2019302.2自由基发生与检测实验模型2.2.1自由基发生体系2.2.2自由基的检测2.23自由基的清除试验29October201931（1）羟基自由基的产生：1、离子辐射（辐射水）。2、过氧化氢和金属离子的反应（Fenton反应）。3、Harber-Weiss反应。4、由臭氧产生的羟基自由基。O3+H2OOH+OH-+O2臭氧是光化学污染的主要成分，也是进攻生物分子的强氧化剂，这些伤害可能都是通过形成羟基自由基来实现的。·2.2.1自由基发生体系29October201932Fenton羟自由基发生羟化产物分析法1894年，Fenton提出FeSO4-H2O2混合物（Fenton试剂），能使许多有机化合物羟基化（如由苯变成苯酚）。在这一反应中，有羟自由基（·OH）形成：H2O2+Fe2+→·OH+OH-+Fe3+Fe3++H2O2→Fe2++HOO·+H+HOO·+H2O2→O2+H2O+·OH29October201933（1）羟自由基发生-Fenton反应1894年，Fenton提出FeSO4-H2O2混合物（Fenton试剂），或抗坏血酸，能使许多有机化合物羟基化（如由苯变成苯酚）。在这一反应中，有羟自由基（·OH）形成：H2O2+Fe2+→·OH+OH-+Fe3+Fe3++H2O2→Fe2++HOO·+H+HOO·+H2O2→O2+H2O+·OH29October201934（2）超氧阴离子自由基的产生方法：1、辐射分解和光化学方法。2、电化学方法。3、KO2在有机溶剂中可以产生超氧阴离子。4、碱性条件下二甲基亚砜可产生超氧阴离子。5、光照核黄素。6、酶促反应（黄嘌呤氧化酶XO）。7、多形核白细胞和巨噬细胞的呼吸爆发。8、邻苯三酚自氧化29October201935邻苯三酚在弱碱性（pH=8.2）Tris-HCl缓冲溶液中，邻苯三酚在碱性条件下自氧化，释放出O2·−，生成有色的中间产物，而该产物在340nm处有一特征吸收峰。（2）超氧自由基发生-邻苯三酚自氧化29October201936在光照下，反应体系中核黄素(VB2)与四甲基乙二胺（或蛋氨酸）反应产生超氧阴离了自由基:（3）超氧自由基发生-光照核黄素29October201937一般来讲，自由基化学性质活泼，寿命极短，但也有例外，例如二苯代苦味肼基自由基(2,2-diphenyl-l-picry-hydrazylradical,DPPH)1958年已把其用于抗氧化剂的筛选研究。由于DPPH·有个单电子并在517nm处有强的吸收，其乙醇溶液呈深紫色。如果有其他物质提供一个电子使此单电子配对，其吸收将会消失，褪色程度与其接受的电子呈定量关系。由于清除剂直接作用于DPPH·自由基，反应时间仅需20min左右，操作简单，且用一般的分光光度计即可测定，因此DPPH·法直接、灵敏、快速、简便。（4）DPPH自由基-人工自由基29Octobe