高级植物病毒学

高级植物病毒学第一讲1.病毒：病毒是一组（一种或一种以上）RNA或DNA核酸模板分子，包被在蛋白或脂蛋白外壳内，在合适的寄主细胞内，依赖于寄主蛋白合成体系、细胞物质和能量完成其复制，随着核酸的变化而发生变异。2.病毒与其他类似生物的区别：⑴与细胞型寄生物的区别：①在细胞内复制期间没有一个连续的膜将病毒与其寄生分开。在寄主细胞内复制的细胞性寄生物总是以一个连续的双层膜（continuousbilayermembrane）与寄主细胞的细胞质分开②病毒中缺少蛋白质合成的系统。③病毒的复制是通过先合成许多组分,随后从组分库中装配出许多病毒粒体（virion或virusparticle）。即使最简单的细胞亦通过二分裂方式进行复制。⑵与质粒的区别：①正常的病毒具有粒子形态，其结构是为在细胞外的环境中保护遗传物质而设计的，并且能够促进病毒进入新的寄主细胞。②病毒基因组为特定的病毒功能而高度地组织化，对寄主细胞没有已知的价值,然而质粒的遗传物质通常对其寄主细胞的生存是有用的。③病毒能引起寄主生物的病害或细胞的死亡，但是质粒不会。⑶与衣原体、立克次氏体、支原体的区别：①大小:一些痘病毒（poxvirus）比衣原体的原体更大。②基因组的性质和大小:许多病毒有像细胞一样的双链DNA,并且一些病毒的DNA比衣原体中的DNA大。③DNA和RNA的存在④病毒和支原体都没有坚硬的细胞包膜。⑤在活的寄主细胞外面，病毒与许多类群的专性细胞性寄生物（cellularparasite）如衣原体都不能生长。⑥病毒和衣原体中没有产生能量的系统。⑦病毒和某些细菌所需的氨基酸等完全依赖于寄主细胞。3.专著和刊物《植物病毒学》《植物病毒研究方法》《植物病毒种类的分子鉴定》《PlantVirology》《微生物学报》《植物保护学报》《植物病理学报》PlantDisease、Phytopathology、MolecularPlantMicrobeInteractions、MolecularPlantPathology、VirusGenes、ArchivesofVirology、VirusResearch、JournalofGeneralVirology第二讲1.类病毒：不具病毒粒体，而是裸露的RNA，能侵染细胞，进行自我复制，称为类病毒。2.卫星核酸：是指依赖于辅助病毒才能复制的线状和环状小分子核酸，其核酸序列与其辅助病毒无显著的同源性，包装在辅助病毒衣壳蛋白内。3.卫星病毒：具有独立的核酸和外壳蛋白、必须依赖于辅助病毒才复制的病毒，并与辅助病毒无同源性。一般干扰辅助病毒的复制。4.拟病毒：包被于辅助病毒衣壳内、类似于类病毒的卫星RNA，大小为300-400bp，具有高度二级结构的单链闭合环状RNA分子。5.蛋白侵染因子：不含核酸，只含约30kDa蛋白质侵染因子，病因未完全明确，暂不列入亚病毒。第三讲病毒的核酸类型（1）正单链RNA（+ssRNA）：单链RNA具有侵染性，可以直接翻译，起mRNA的作用。大部分重要植物病毒的基因组属这一类型。如TMV，CMV，PVY；多分体病毒。（2）负单链RNA（-ssRNA）：病毒粒体中的单链RNA不具侵染性，必需先转录成互补链，才能翻译蛋白。植物弹状病毒的基因组属这一类型，如NCMV。（3）双链RNA（dsRNA）：其中一条链具有mRNA的作用。负链变正链才能作为mRNA。植物呼肠孤病毒的基因组属这一类型，如RDV。（4）单链DNA（ssDNA）：联体病毒科病毒含有这种类型基因组，复制时单链DNA先合成双链DNA，再以常规途径转录生成mRNA，如WDV。（5）双链DNA（dsDNA）：核酸类型与高等动、植物的相同，为互补的双链DNA，如CaMV，杆状DNA病毒属具有这种类型基因组。。第四讲1.病毒基因组结构：一般来讲，病毒基因组包括编码区（codingregions）和非编码区(non-codingregions)。编码区所表达的蛋白要参与病毒的侵染循环、病毒在植株内的运动及植株间的传播以及与寄主植物的互作。非编码区调控基因组的复制与基因表达，但调控序列也可能存在于编码序列内。2.病毒基因组的特点：⑴基因组大小相差很大：WDV：2.75kb痘病毒：300kb⑵核酸结构多样性：DNA或RNA；单链或双链；环状分子或线性分子⑶基因组有连续的，有不连续的：大多数连续；RDV：12条dSRNA⑷编码序列90%(基因组)⑸多为单拷贝，即每个基因只出现一次⑹基因有连续的和间断的(有内含子)⑺相关基因丛集:功能上相关的基因排列在一起⑻有重叠基因⑼含有不规则结构基因：基因之间无间隔区；mRNA５＇端无帽子结构；结构基因本身无翻译起始序列3.表达策略⑴多聚蛋白策略：按病毒基因组的5'3'方向进行翻译，形成一个大的多肽，这其中包含某种蛋白酶，再进行翻译后的切割，把一个Polyprotein分成几个有功能的多肽。该策略在马铃薯Y病毒科的病毒中普遍存在。多聚蛋白的策略能克服非5'端的起始密码子问题外，还能使几个功能蛋白同时表达，更加容易调节整个生化途径。⑵亚基因组RNA策略：亚基因组RNAs（sgRNA）是在病毒的复制过程中从基因组RNA上合成的具有截短的5'端和共同的3'端的基因组分。原来在下游的编码框就变成mRNA的5'末端。当在基因组的3'末端有几个基因存在时，一系列具有共同3'末端的sgRNA产生。⑶中间起始策略：翻译不是从5'端的AUG启动子开始的，而是起始于中间的核糖体进入位点（IRES）或核糖体着陆点。IRES形成一个复杂的二级或三级结构以使核糖体和激活因子结合。⑷略读策略：40S核糖体亚基开始从RNA的5'端开始扫描，但是并不是所有的都从第一个AUG开始翻译的。有时会略过第一个AUG，从后面的AUG开始起始翻译。在有些情况下，40S核糖体亚基在终止密码子的位置不离开RNA链，又重新开始寻找下一个起始密码子。⑸多分体基因组策略：多分体基因组病毒在病毒的复制循环中需要把基因组分成几个核酸片断。DNA病毒和RNA病毒中都存在这方面的情况。对于正意的ssRNA病毒来说，这个策略可以把基因放在每一个RNA片断的5'末端并能直接翻译成蛋白产物。在70个植物病毒属中，28个有多组分基因组。4.病毒基因组的非编码区的末端结构植物病毒的ssRNA基因组在其5'或3'末端形成特殊结构。（1）5'端帽子（cap）结构：（2）5'连接蛋白：（3）3'端Poly(A)结构（4）3'端类似tRNA结构：（5）互补的5'和3'序列第五讲1.RNA病毒复制方式⑴+ssRNA病毒的复制：+ssRNA病毒进入寄主后释放出RNA，其5’端结合到寄主的核糖体上，它与寄主核糖体的亲和力比寄主的mRNA大1000倍。RNA释放并不是一下完成的，而是从5'端逐渐向外释放，然后顺来进行翻译，先翻译出RNA聚合酶（RdRp），及其它病毒专化蛋白，再从3'端开始复制整个基因组形成负链，再在负链上合成正链。最后外壳蛋白亚基和RNA链组装成新的病毒粒体，聚集在细胞质中。⑵-ssRNA病毒的复制：植物弹状病毒具有-ssRNA基因组，与其复制有关的蛋白有核衣壳蛋白（N），被认为是复制酶的1种大蛋白（L）和基质蛋白（M）。植物弹状病毒的-ssRNA基因组有两个功能，作为mRNA转录的模板以及作为复制模板。其细胞核弹状病毒的复制过程如下：Ⅰ、进入到细胞后，病毒与内质网（ER）结合，把核蛋白壳核心释放到细胞质中。Ⅱ、核蛋白壳核心经由核孔进入细胞核中。Ⅲ、在L蛋白的催化下进行早期转录，形成的mRNA进入细胞质并翻译。Ⅳ、核心的复制酶蛋白N、M2和L进入到细胞核中，催化基因组RNA的复制并进行晚期mRNA的转录。Ⅴ、在细胞核的周边形成含有N、M2和L蛋白的颗粒状电子浓密的病毒质体（viroplasms）,病毒在此复制。Ⅵ、在复制的晚期，M蛋白与新合成的核蛋白核心结合并缠绕在上，该复合体再与G蛋白结合，聚集在内核膜上。Ⅶ、新合成的病毒粒体进入核的外周空间。⑶双链RNA病毒的复制①细胞内的复制位点：在细胞质中复制，侵染后，在细胞质中可出现染色浓密的病毒质体。②RNA的装配：有2个识别信号，其一是对病毒的基因组特异的，其二是对10-12条dsRNA分子特异的。③复制：在呼肠孤病毒中，负链是在病毒质体中由病毒复制酶以正链为模板合成的，形成的dsRNA最终装配成病毒粒体。2.病毒提纯的原则不同病毒往往依据提纯的目的和要求不同，设计不同的提纯方案：如（1）制作抗血清，尽量除去寄主的各种抗原成分（2）拟用于病毒核酸性质研究，尽量除去寄主的各类核酸或核酸衍生物设计具体的提纯方案设计时：（1）应查找前人资料，看是否前人资料能直接利用；（2）依据提纯目的和现有实验条件对前人方法进行改进；（3）依据病毒和繁殖寄主的特性创造提纯方法。从初提纯开始，每一步最好用一定的检验方法对提纯中的病毒进行监测，如血清学检测、电镜观察、电泳分析、紫外扫描等。第六讲1.植物病毒遗传变异的分子基础病毒在其生命过程中可因突变和重组产生变异。⑴突变：病毒基因组核苷酸序列的任何改变被认为是一种突变，包括点突变、缺失和插入。①点突变：主要发生在由于RNA基因组在复制过程中低的准确性，特别是在RNA复制过程中所涉及的酶（病毒的RdRp或复制酶）缺乏校正活性所致。另一种可能的机制是称为RNA编辑（RNAediting）的转录后碱基的修饰过程。②插入和缺失：插入可能是较长的RNA片段或仅几个非模板的核苷酸，通常的情况下较长RNA片段的插入是由于RNA重组所致，而少数几个非模板核苷酸的插入是由于在难被复制酶拷贝的模板区域RNA复制酶的错误所导致。缺失常出现在缺陷干扰RNA中，象插入一样，缺失片段的大小从几个核苷酸到大片段的RNA分子。③移码突变：当缺失或插入改变通常的遗传三联体密码子时，就会在翻译过程中发生核糖体的移码作用。④突变体的稳定性：除了缺失突变外，多数突变体能够进行逆的突变，分为回复突变和补偿突变两种类型。⑵重组：两个基因组之间发生遗传物质的交换称为重组。①“典型”重组：这种类型的重组在DNA病毒以及具有DNA阶段的RNA病毒（反转录病毒）是普遍存在的，因为寄主细胞中具有DNA重组的系统。②RNA重组：RNA-RNA重组可发生在不同的病毒RNA（来源于不同病毒或同一病毒），并有同源或非同源交换体的出现。前者发生在两个几乎相同的RNA或几乎相同的RNA区域，而后者发生在不相关的RNA（或不相同的区域）间。⑶缺陷干扰（DI）RNA：在RNA病毒的侵染过程中，经常伴有源于Helper病毒基因组的DIRNA的存在，由于DIRNA干扰Helper病毒的积累，它们对于控制Helper病毒的病害严重度和对RNA病毒进化适合性的各个方面起重要作用。⑷表现型混合2.血清学检测方法与原理⑴酶联免疫吸附法：用酶作标记物或指示剂进行抗原和抗体定性、定量、定位测定的技术，灵敏度高（1－10ng/mg病毒）、特异性强、操作简便，广泛用于病毒的诊断和鉴定。①直接法：用特异性酶标抗体直接检出样品中的抗原。②间接法：用酶标记抗抗体检出抗原。③双抗体夹心法：双抗体检出抗原的方法。④斑点ELISA法：以硝酸纤维素膜作载体进行的ELISA法。⑵免疫双扩散法：以琼脂糖或琼脂凝胶作为扩散反应的介质，由抗原和抗体在介质扩散中相遇，而在某一位置上形成肉眼可见的沉淀线。⑶免疫吸附电镜技术：将免疫与电镜技术结合，用以检测抗原和抗体特异性结合的方法。3.双链RNA分析和核酸鉴定技术⑴双链RNA技术：植物基因组很少存在dsRNA，即使存在，其分子量很小，而RNA侵染病毒后，在植物中都存在较大分子量的dsRNA（分子量﹥1×106)。因此，检测植物中dSRNA存在，可以确定植物是否受到RNA病毒的侵染，对于判断是否是RNA病毒侵染的有效检测方法。⑵PCR技术：在模板指导、引物引导、聚合酶催化的DNA特异片段的周期性体外扩增反应。原理和程序：①模板DNA②引物：人工合成的DNA片段（15-30bp)③周期性扩增：变性（94－95℃）、退火（37-60℃）、延伸（72℃）第七讲MP的十大特性：⑴由于是一种非