二、α-淀粉酶活力的测定2010(精)

生物技术专业系统实验（四）——酶（蛋白质）工程实验II二、α-淀粉酶活力的测定--国家标准GB8275-20091.目的意义2.实验原理3.试剂和溶液4.仪器和器材5.实验方法6.实验报告7.思考题1.目的意义淀粉是葡萄糖以α-1,4糖苷键及α-1，6糖苷键连结的高分子多糖，是人类和动物的主要食物，也是食品、发酵、酿造、医药、纺织工业的基本原料。淀粉酶(amylase)是能够水解淀粉分子链中的α-1,4糖苷键，将淀粉链切断成为短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，是淀粉粘度迅速下降的酶制剂。包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶。它们广泛存在于动物界、植物和微生物界。除特殊的外，一般淀粉酶对于生的淀粉不起作用，只作用于糊化后的淀粉。不同来源的淀粉酶，性质有所不同。其中最重要的淀粉酶是α-淀粉酶。•3DStructuralofanα-Amylaseα-淀粉酶是淀粉及以淀粉为材料的工业生产中最重要的一种水解酶，其最早的商业化应用在1984年，作为治疗消化紊乱的药物辅助剂。α-淀粉酶对淀粉的分解作用是工业上利用淀粉的基础，如纺织工业上的退浆；酶法糖化制造葡萄糖、麦芽糖；酶法制造酒精、料酒等。例如，生产葡萄糖需要葡萄糖淀粉酶，但仅有葡萄糖淀粉酶作用，不能液化淀粉溶液，葡萄糖的生成速度非常慢。此时，α-淀粉酶的使用就成为必要条件。α-淀粉酶的活性测定，在理论研究和实际应用中具有重要的意义。通过本实验，学习一种测定α-淀粉酶酶活力的方法，巩固并熟练分光光度计的使用方法。2.实验原理α-淀粉酶能够将淀粉分子中的α-1，4糖苷键随机切成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘的呈蓝色特性反应逐渐消失，呈现棕红色，其颜色消逝的速度与酶活性有关，可以用来表示淀粉酶水解的程度，因而能购通过反应后溶液的吸光度值衡量酶的活力。3.试剂和溶液3.1原碘液称取2.2g碘和4.4g碘化钾完全溶解后定容至100ml，储存于棕色瓶中（教师准备）。3.2稀碘液吸取原碘液2ml，加20g碘化钾用水溶解并定容至500ml。3.3可溶性淀粉溶液称取2.000g（精确到0.001g）可溶性淀粉于烧杯中，加适量蒸馏水调成浆糊状物，边搅拌边加入沸水90ml，搅拌加热至完全透明冷却后定容至100ml，现配现用。3.4磷酸缓冲液（pH6.0）4.52g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和0.8g柠檬酸（C6H8O7·H2O），定容至100ml。pH计校正后使用。3.5盐酸溶液（0.1M/L）100ml4.仪器及器材4.1仪器电子天平2台恒温水浴锅每组1台分光光度计每组1台记时器每组1台3.2器材（每组）15ml大试管10支5ml移液管10支1ml移液管5支10ml移液管10支比色皿1套（4个）双蒸水1瓶（50ml）洗瓶1个玻璃平皿1套50ml小广口瓶（棕色）2个50ml容量瓶1个100ml容量瓶1个500ml试剂瓶2个100ml试剂瓶2个250ml三角瓶2个200ml烧杯2个500ml烧杯1个记号笔1支、吸耳球、称量纸、药勺、试管架、研钵、纱布5.实验方法—GB8275-2009法将淀粉作为底物，通过比色法测定碘显蓝反应色值的减少以测定α-淀粉酶活力的方法。5.1分析方法5.1.1待测酶液的制备精确称取1g酶粉，用少量pH6.0磷酸缓冲液充分溶解，将上清小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至100ml，摇匀。四层纱布过滤，滤液放置于4℃冰箱待用。使用前倍稀释。5.1.2测定A液：吸取20ml可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液5ml，充分混匀后，置于60℃恒温水浴中预热5minB液：将1ml稀释好的待测酶液加入A液，摇匀，立即计时，准确反应5minC液：将0.5ml0.1mol/L盐酸和5ml稀碘液加入试管中，摇匀待用立即用移液器吸取1mlB液，加入预先盛有C液的试管中，摇匀同时设置空白组（以1ml磷酸缓冲液取代1ml稀释酶液）于660nm波长下，用10mm比色皿迅速测定其吸光度值（A）根据吸光度表C1，查得所测酶液的酶活力5.1.3计算酶活力X=c×n其中：X—样品的酶活力，单位为u/gc—测试酶液的酶活力，单位为u/gn—样品的稀释倍数5.3注意事项酶反应时间应准确计算。试剂加入按规定顺序进行。6.实验报告酶活(u/g)1st2nd3rd平均值6.1根据所得数据填写实验报告表注：各测三次6.2讨论实验中遇见的问题及解决的方法；数据、结果的相关分析；7.思考题1、淀粉酶活性测定原理是什么？2、测定酶活力，应注意什么问题？