第十六章细胞死亡与细胞衰老

本章主要内容●细胞凋亡(Apoptosis)●细胞衰老(cellularaging）就单细胞生物而言，细胞死亡即个体的死亡。对于多细胞生物，细胞死亡是维持生物体的正常生长发育及生命活动的必要条件。细胞死亡方式包括：细胞凋亡、坏死、自噬性细胞死亡。它们具有不同形态和分子特征，发挥不同的功能，但均受到细胞内在基因控制。第一节细胞死亡第一节细胞死亡程序性细胞死亡（programmeddeath,PCD）：细胞死亡受细胞内由遗传机制决定的“死亡程序”控制，要求特定的基因表达，是“主动”而非“被动”的过程。死亡方式主要包括3种：凋亡、坏死、由细胞自噬导致的自噬性细胞死亡。一、细胞凋亡◆细胞凋亡概念◆细胞凋亡特征◆细胞凋亡检测◆凋亡的生理学及医学意义◆凋亡的分子机制●细胞凋亡(apoptosis)：一种有序的或程序性的细胞死亡方式，是细胞接受某些特定信号刺激后进行的正常生理应答反应。该过程具有典型的形态学和生化特征，凋亡细胞最后以凋亡小体被吞噬消化。●Apoptosis的概念源自于希腊语，原意是指树叶或花的自然凋落。细胞发生程序性死亡时，就像树叶或花的自然凋落一样，凋亡的细胞散在于正常组织细胞中，被巨噬细胞吞噬，无炎症反应，不遗留疤痕。细胞凋亡的概念（一）细胞凋亡的特征◆形态特征质膜内折；染色质固缩；有凋亡小体（一）细胞凋亡的特征◆凋亡的起始：细胞表面的特化结构消失，细胞膜依然完整；线粒体大体完整，核糖体逐渐与内质网脱离，内质网囊腔膨胀，并逐渐与质膜融合；染色质固缩，沿着核膜分布。◆凋亡小体的形成：染色质断裂，与某些细胞器等聚集在一起，被反折细胞质膜包裹，形成球形的结构，称为凋亡小体。◆凋亡小体为邻近细胞或吞噬细胞所吞噬，在溶酶体内被消化分解。细胞凋亡的过程及特征（一）细胞凋亡的特征（二）细胞凋亡的检测方法◆形态学观察：化学染色法（台盼蓝）和荧光染色（DAPI染细胞核）、吉姆萨染色法（染色质着色）◆DNA电泳：呈现出梯状条带（DNAladders）◆DNA断裂的原位末断标记：凋亡细胞的核DNA断裂后产生3’-OH末端，用荧光素对凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色。a正常T细胞杂交瘤细胞b凋亡细胞(扫描电镜)c凋亡细胞(透射电镜)（二）细胞凋亡的检测方法◆DNA在核小体间断裂形成180——200bp的片段，琼脂电泳出现梯状条带。细胞色素c诱导的凋亡细胞DNA电泳图1．细胞色素c诱导0h2．细胞色素c诱导1h3．细胞色素c诱导2h4．细胞色素c诱导3h5．细胞色素c诱导4h6．阴性对照7．Marker凋亡细胞的DNA电泳◆彗星电泳法：凋亡细胞中DNA降解片段泳动速度较快，使细胞核呈现彗星式图案。◆流式细胞分析：凋亡的亚二倍体细胞。◆检测细胞膜成分变化：磷脂酰丝氨酸翻转至细胞膜外侧。（二）细胞凋亡的检测方法●生物发育过程中的需要●参与免疫耐受的形成：对识别自身抗原的T细胞克隆进行选择性地消除。●生理性保护机制，清除体内多余、受损或危险的细胞而不对周围的细胞或组织产生伤害。●维持机体细胞总数的平衡和机体的生命活力。●人体细胞凋亡的失调，引发多种疾病。凋亡不足引发肿瘤和自身免疫病；过度凋亡导致免疫功能的丧失或引发炎症。（三）细胞凋亡的生理学及医学意义蝌蚪在向成体变态发育过程中尾的消失脊椎动物的神经系统发育细胞凋亡使神经细胞与靶细胞的数量相匹配发育过程中手和足的成形过程（四）细胞凋亡的分子机制●caspase家族●caspase切割底物●外界信号与凋亡●线粒体与凋亡诱导细胞凋亡的因子◆物理性因子:包括射线（紫外线，射线等）；较温和的温度刺激（如热激，冷激）等。◆化学及生物因子：包括活性氧基团和分子（超氧自由基，Ｈ２Ｏ２）；DNA和蛋白质合成的抑制剂；正常生理因子（激素，细胞生长因子等）失调；凋亡因子如肿瘤坏死因子（TNF）处理等。1、caspase家族线虫Caenorhabditiselegans是研究个体发育和细胞程序性死亡的理想材料（生命周期短，细胞数量少）。线虫神经系统由302个细胞组成。这些细胞来自于407个前体细胞。也就是说105个细胞发生了程序性死亡。◆caspase的发现◆caspase的发现控制线虫细胞凋亡的基因主要有3个：Ced-3、Ced-4和Ced-9Ced-3和Ced-4的作用是诱发凋亡；Ced-9阻止Ced-3、Ced-4激活，抑制细胞凋亡。Ced3哺乳类同源物是白介素－１转换酶(Interleukin-1-convertingenzyme，ICE)，即caspase1。caspase家族◆哺乳动物细胞中发现15种caspase蛋白。根据在细胞凋亡过程中发挥的功能不同，可分为两类：◆凋亡起始者（起始caspases）：2、8、9、10、11参与凋亡启动，负责对效应者的前体切割，产生有活性的效应者。◆凋亡执行者（效应caspases）：3、6、7执行细胞凋亡，负责切割细胞核内、细胞质中结构蛋白和调节蛋白，使其失活或活化，保证凋亡程序的正常进行。caspase是天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶的简称。caspase活性位点是半胱氨酸，切割位点是靶蛋白天冬氨酸残基后的肽键。caspase家族2、caspases依赖性细胞凋亡途径●由死亡受体起始的外源途径●由线粒体起始的内源途径（1）死亡受体介导的细胞凋亡◆当细胞接受凋亡信号分子(FasＬ,TNF等)后，凋亡细胞表面信号分子受体相互聚集并与细胞内的衔接蛋白结合。◆衔接蛋白募集caspases2、8和10聚集在受体部位。◆caspase相互活化并产生级联反应，使细胞凋亡。细胞凋亡过程中caspases级联效应胞外信号诱导细胞凋亡2、8和10凋亡起始◆下游caspases活化后，作用于底物。裂解核纤层蛋白，导致细胞核形成凋亡小体；裂解DNase结合蛋白，使DNase释放，降解DNA形成DNALadder；裂解参与细胞连接或附着的骨架和其他蛋白，使凋亡细胞皱缩、脱落，便于细胞吞噬；导致膜脂重排，便于吞噬细胞识别并吞噬。（1）死亡受体介导的细胞凋亡fasfas又称作APO-1，属TNF受体和NGF受体家族。1993年人白细胞分型国际会议统一命名为CD95。fas基因编码产物为分子量45KD的跨膜蛋白。Fas蛋白与Fas配体组成Fas系统，二者的结合导致靶细胞走向凋亡。Fas诱导的细胞凋亡Fas与配体（如TNF）结合发生三聚化，使胞内的DD区（Deathdomain）与接头蛋白FADD的DD区结合。FADDN端通过DED区（deatheffectordomain）与Caspase-8前体蛋白和CAP3结合，激活caspase-8。caspase-8酶原自剪切活化，切割效应caspase（caspase-3酶原），产生有活性的caspase-3，导致细胞凋亡。caspase可降解结构蛋白、信号蛋白、转录调控蛋白、周期蛋白等等。活化的caspase-8还通过切割信号分子Bid，将凋亡信号传递到线粒体，引发凋亡的内源途径，使凋亡信号进一步扩大。（2）细胞凋亡的内源途径◆当caspase8活化后，其中一个途径被运送到线粒体，导致细胞色素C释放。◆CytC与胞质中Apaf-1(凋亡蛋白酶活化因子)结合诱导细胞凋亡Apaf-1：线虫Ced4在哺乳动物细胞中的同源蛋白，通过N端CARD结构域（caspases募集结构域）招募细胞质中的caspase9酶原。◆caspase9酶原在凋亡复合体中发生自身切割而活化。◆活化的caspase9切割并激活caspase3、7，引发细胞凋亡。细胞凋亡信号途径线粒体向细胞质内释放多个凋亡相关因子，诱发caspases非依赖性的细胞凋亡。凋亡诱导因子（AIF）：从线粒体释放到细胞质基质中，进而进入细胞核，引起核内DNA凝集并断裂。限制性内切核酸酶G（endonucleaseG）:负责线粒体DNA的修复和复制。受到凋亡信号的刺激，endoG从线粒体释放，进入细胞核，对核DNA进行切割。3、caspases非依赖性的细胞凋亡2002年10月7日英国人悉尼·布雷诺尔、美国人罗伯特·霍维茨和英国人约翰·苏尔斯顿，因在细胞程序性死亡方面的研究获诺贝尔诺贝尔生理与医学奖。SydneyBrennerH.RobertHorvitzJohnE.Sulston二、细胞坏死细胞坏死是细胞受到急性强力伤害时立即出现的反应。早期表现为细胞膜破坏，线粒体肿胀。继而溶酶体破裂,细胞内容物流出,引起炎症。细胞凋亡与细胞坏死比较Kerr（1972）最先提出，与细胞坏死的区别是：①细胞通过出芽的方式形成许多凋亡小体；②凋亡小体内有结构完整的细胞器；③不引起炎症；④线粒体无变化，溶酶体活性不增加；⑤内切酶活化，DNA有控降解，凝胶电泳图谱呈梯状；⑥凋亡通常是生理性变化，而细胞坏死是病理性变化。坏死细胞凋亡细胞细胞坏死细胞坏死时，细胞质膜发生渗漏。细胞内容物，包括膨大和破碎的细胞器以及染色质片段，释放到胞外，导致炎症反应。染色质不发生凝集，也不产生有规律的200bp的DNA降解片段，而是被随机降解，电泳时产生“拖尾”现象。细胞坏死的作用细胞坏死可能在细胞的免疫反应中发挥重要作用。细胞感染病原体后，可能通过“自杀”方式消灭病原体，可以作为凋亡的“替补”。被感染的细胞坏死后，胞内的病原体信号分子如病毒核酸等被释放，能够被免疫细胞识别，促发固有免疫反应。三、自噬性细胞死亡细胞自噬：细胞通过溶酶体与双层膜包裹的细胞自身物质融合，从而降解细胞自身物质的过程。寿命较短的蛋白质通过泛素-蛋白酶体系统进行降解；寿命较长的蛋白质及细胞结构通过细胞自噬途径，由溶酶体进行降解。细胞自噬过程膜泡的形成、扩展自噬体的形成自噬体与溶酶体融合后形成自噬溶酶体内含物被溶酶体中的水解酶消化三、自噬性细胞死亡细胞自噬的特征及过程第二节细胞衰老◆衰老的概念◆Hayflick界限◆衰老特征◆衰老的分子理论（一）衰老的概念●细胞衰老(cellaging，cellsenescence)：一般指复制衰老，即体外培养的正常细胞经过有限次数的分裂后，停止生长，细胞形态和生理代谢活动发生显著改变的现象。●培养细胞的衰老，机体内细胞的衰老（二）Hayflick界限●1961年，Hayflick首次报道了体外培养的人成纤维细胞具有增殖分裂的极限。●Hayflick界限：细胞，至少是培养的细胞，不是不死，是有一定寿命的；它们的增殖能力不是无限的，而是有一定的界限，平均传代40——60次，此后细胞逐渐解体死亡。（二）Hayflick界限◆癌细胞或培养的细胞系是不正常细胞，其染色体数目或形态已经不同于原先的细胞◆细胞的增殖能力与供体年龄有关◆物种寿命与培养细胞寿命之间存在着一定的关系细胞来源人胚肺成纤维细胞中年人成纤维细胞老年人成纤维细胞可增殖代数40-60202-4不同年龄来源的人成纤维细胞的增殖代数物种的寿命与体外培养时细胞传代次数的关系三、衰老细胞结构的变化●细胞核的变化●内质网的变化:衰老动物内质网弥散性分散于核周胞质中，肿胀，糙面内质网总量似乎是减少了，蛋白质合成量减少。●线粒体的变化:通常，细胞中线粒体的数量随龄减少，而其体积则随龄增大。●致密体的生成：由溶酶体或线粒体转化而来。●膜系统的变化细胞核的变化◆体外培养的二倍体细胞，细胞核随着细胞分裂次数的增加不断增大。◆细胞核的核膜内折，染色质固缩化。膜系统的变化◆衰老的细胞，其膜流动性降低、韧性减小。◆衰老细胞间，间隙连接减少;细胞膜内（P面）颗粒的分布也发生变化对于体外培养细胞，细胞衰老时，生物学特征有两个：生长停滞，细胞停止分裂，停滞是不可逆的。衰老相关的半乳糖苷酶的活化。四、细胞衰老的分子机制复制衰老的机制：细胞衰老的端粒假说压力诱导的早熟性衰老：氧化损伤积累理论单细胞生物的衰老：rDNA与细胞衰老细胞衰老的端粒假说端粒与衰老：发现端粒长度确实与衰老有着密切的关系，提出细胞衰老的“有丝分裂钟”学说（Harley,1990）。复制型衰老的信号通路氧化性损伤学说氧化性损