基因工程实验操作技术

总RNA的提取（Trizol法提取）在收集到生物材料之后，最好能即刻进行RNA制备工作。若需暂时储存，则应以液氮将生物材料急速冷冻后，储存于-80℃冷冻柜。在制备RNA时，将储存于冷冻柜的材料取出，立即以加入液氮研磨的方式打破细胞，不可以先行解冻，以避免RNase的作用。1.提取组织RNA时，每50～100mg组织用1mlTrizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时，先离心沉淀细胞，每5-10╳106个细胞加1mlTrizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞；2.将上述组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中,在室温15~30C下放置5分钟；3.在上述EP管中，按照每1mlTRIZOL加0.2ml氯仿的量加入氯仿，盖上EP管盖子，在手中用力震荡15秒，在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后，12000g（2℃～8℃）离心15分钟；4.取上层水相置于新EP管中,按照每1mlTRIZOL加0.5ml异丙醇的量加入异丙醇，在室温下（15℃～30℃）放置10分钟,12000g（2℃～8℃）离心10分钟；5.弃上清，按照每1mlTRIZOL加1ml75%乙醇进行洗涤，涡旋混合，7500g（2℃～8℃）离心5分钟，弃上清；6.让沉淀的RNA在室温下自然干燥；7.用Rnase-freewater溶解RNA沉淀。PCR实验室常用DNA聚合酶有三种：TaKaRaTaqTM，TaKaRaEXTaqTM和PyrobestTMDNAPolymerase。TaKaRaTaqTM是一般的DNA聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRaEXTaqTM是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物3’端附有一个“A”碱基，如果希望直接将产物克隆到T-vector可以用此酶。PyrobestTMDNAPolymerase也是具有Proofreading活性的耐热性DNA聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增请使用此酶。1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液：TaKaRaTaqTM或TaKaRaEXTaqTM的配方ReagentQuantity,for50µlofreactionmixture10XPCRbuffer（Mg2+free）5µlMgCl2（25mM）如TaKaRaTaqTM加3µl如TaKaRaEXTaqTM加4µl2.5mMdNTPmix4µl10µMPrimer上游1µl10µMPrimer下游1µlTemplateDNA1µlTaq或EXTaqDNAPolymerase0.25µlSteriledeionizedwaterUpto50µlTotal50µl/SamplePyrobestTMDNAPolymerase的配方ReagentQuantity,for50µlofreactionmixture10XPyrobestbuffer5µl2.5mMdNTPmix4µl10µMPrimer上游1µl10µMPrimer下游1µlTemplateDNA1µlPyrobestTMDNAPolymerase0.25µlSteriledeionizedwaterUpto50µlTotal50µl/Sample①反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl以节约试剂；②将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；③如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30~50µl的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；2.按以下程序进行PCR扩增。PCR反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及PCR结果而进行优化。StepTemperature,°CTime,minNumberofcyclesNote起始变性94~951-31变性94~950.5-225-35退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化退火37-700.5-2延伸70-75根据扩增产物的大小每分钟延伸1000bp最终延伸70-75101反应结束后，抽取扩增样品5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNAmarker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。RT-PCRProtocol:TaKaRaOneStepRNAPCRKit(AMV)1.按下列组成在PCR反应管中调制反应液ReagentQuantity,for50µlofreactionmixture10×OneStepRNAPCRBuffer5µl25mMMgCl210µl10mMdNTPmix5µlRNaseInhibitor(40U/µl)1µlAMV-OptimizedTaq1µlAMVRTaseXL(5U/µl)1µl上游特异Primer(20µM)1µl下游特异Primer(20µM)1µl实验样品RNA（≤1µgTotalRNA）1µlRNaseFreedH2O24µlTotal50µl/Sample1.反应总体积根据实际情况进行调控，可以做20~50µl以节约试剂；2.将上表各成分加入到0.2ml或0.5ml灭菌的PCR薄壁管中；3.如果不用PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加30~50µl的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发；2．按以下条件进行反应StepTemperature,°CTime,minNumberofcyclesNote逆转录50301逆转录酶失活9421变性940.525-35退火37-650.5退火温度比理论退火温度大概低5°C，再根据反应结果优化延伸72根据扩增产物的大小Taq酶每分钟延伸1000bp最终延伸72101反应结束后，抽取扩增样品5µl，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNAmarker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用。琼脂糖核酸电泳1.用蒸馏水将制胶模具和梳子冲洗干净，放在制胶平板上，封闭模具边缘，架好梳子；2.根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液（一般20~30ml）；3.放入到微波炉内加热熔化。冷却片刻，加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液，倒入电泳槽中，待其凝固；4.室温下30~45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在电泳槽内；5.向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1mm为宜，如样品孔内有气泡，应设法除去；6.在DNA样品中加入10×体积的载样缓冲液（loadingbuffer），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶加样孔内；7.接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。一般60～100V电压，电泳20～40min即可；8.根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳；9.电泳完毕，关上电源，在凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围琼脂糖凝胶浓度线形DNA的最佳分辨范围（bp）0.5%1,000～30,0000.7%800～12,0001.0%500～10,0001.2%400～7,0001.5%200～3,0002.0%50～2,000胶回收纯化DNA1.琼脂糖电泳，将特异电泳带用刀切下放入到EP管中，称琼脂糖带的重量；2.按照每100mg加400µl的量加入bindingbuffer，放入到EP管振荡器中，45℃～55℃温育振荡，直到所有的琼脂糖都溶解（大概要5分钟）；3.取出纯化柱，将上述溶解液转移至柱中，室温下放置2分钟，8,000rpm离心1分钟，弃EP管中的液体，将纯化柱放回EP管中；4.加500µl的washbuffer至柱中，8,000rpm离心1分钟。弃管中的溶液；5.重复操作4步的操作1次，最后将纯化柱放入EP管中10,000rpm离心30秒，除去痕量的washbuffer；6.将纯化柱放入一个新的EP管。加30~40µlH2O或者elutionbuffer至纯化柱膜的中央，在37℃或50℃下放置2分钟，10,000rpm离心1分钟洗脱DNA，将EP管中的DNA溶液放在-20℃保存。7.注：若想要不电泳而直接纯化DNA溶液，只需要在第2步中按100µl液量加400µl的bindingbuffer,其余的步骤不变。大肠杆菌质粒DNA的提取（碱裂解法）此方法适用于小量质粒DNA的提取提取的质粒DNA可直接用于酶切PCR扩增。1.取1.5ml细菌培养物于EP管中，4000rpm离心1分钟，弃上清液，使细菌沉淀尽量干燥；2.将细菌沉淀重悬于用冰预冷的100µl溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTApH8.0，25mmol/LTris-HClpH8.0)中，剧烈振荡；3.加入200µl新配制的溶液II(0.2mol/LNaOH，1％SDS（m/v）)，盖紧EP管口，快速颠倒离心管5次，以混合混合物，确保离心管的整个内表面与溶液II接触，不要涡旋，置于冰浴中；4.加入150µl预冷溶液III(每100ml的溶液III中含60ml5mol/L乙酸钾，11.5ml冰乙酸，28.5mlH2O)，盖紧EP管口，反复颠倒数次，使溶液III在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3~5分钟；5.在最大转速下离心5min，取上清液于另一新EP管；6.用两倍体积的乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合于室温放置2分钟，最大转速离心5分钟；7.小心吸去上清液，将离心管倒置于滤纸上，以使所有液体都流出，在将附于管壁的液滴除尽；8.加1ml70％乙醇洗涤沉淀，振荡混合，用12,000g离心2分钟，弃上清，将开口的EP管置于室温使乙醇挥发，直至EP管中内没有可见的液体存在（5～10分钟），用适量的ddH2O溶解；9.用0.5µl的RNase37℃温育5~10分钟；10.电泳鉴定。乙醇沉淀DNA1.加入1/10体积的乙酸钠（3mol∕L，PH=5.2）于DNA溶液中充分混匀，使其最终浓度为0.3mol∕L；2.加入2倍体积用冰预冷的乙醇混合后再次充分混匀置于-20℃中15~30分钟；3.12,000g离心10分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；4.加入1/2离心管容量的70％乙醇，12000g离心2分钟，小心移出上清液，吸去管壁上所有的液滴；5.于室温下将开盖的EP管的置于实验桌上以使残留的液体挥发至干；6.加适量的ddH2O溶解DNA沉淀。酶切1.酶切前确定待切样品的浓度,并选择合适的限制性内切酶和配套Buffer。2.在离心管中加入如下成分：10×Buffer1μl待切样品xμl酶0.5-1μl加水补足10μl3.混匀样品并短暂离心使样品沉于管底。4.将离心管置于37℃中温育1-3hr，若待切样品为PCR产物，则可将反应时间适当延长。5.用未酶切的质粒作为对照，琼脂糖电泳鉴定酶切结果。注：当酶切样品用于回收而不是鉴定时，可按比例适当加大反应体积。双酶切可选用二者活性都较高的Buffer或者通用Buffer，但要注意不能有星反应。）连接1.连接前先电泳确定待连接载体与片段的浓度。2.在离心管中加入如下成分：10×连接Buffer1μl待连接的样品（胶回收产物或PCR产物，载体与片段的mol比为1∶3-5）连接酶0.5-1μl加水补足10μl3.混匀样品并短暂离心使样品全部沉于管底。4.将离心管置于连接酶要求的温度孵育适当的时间（根据不同公司的酶的要求而定，一般为22℃1-3hr或16℃连接过夜）。连接完的样品可直接用于转化，也可放4℃冰箱短期保存。感受态细胞的制备1.挑取适当菌株的E.coli单菌落接种于2mlSOB培养液中，37℃摇床过夜。2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50mlSOB中，18℃剧烈震荡，直到A600达到0.6。3.将培养物转移到50ml离心管中，4℃4,000rpm/min离心10min。同时在冰浴上配置TB溶液。4.弃上清，将离心管倒置于滤纸上，使培养