IPP使用教程

Imagepro-Plus6.0使用教程目录一、入门.................................................................................................................................................................2二、AOI技巧（1）................................................................................................................................................9三、AOI技巧（2）..............................................................................................................................................14补充：不规则区域计数...............................................................................................................................20四、编制宏...........................................................................................................................................................23五、计数...............................................................................................................................................................27六、校正标尺.......................................................................................................................................................33七、几何测量.......................................................................................................................................................41八、图象分析策略...............................................................................................................................................43九、其他有趣功能...............................................................................................................................................45十、光密度...........................................................................................................................................................51十一、免疫组化光密度测量...............................................................................................................................56十二、macro.........................................................................................................................................................58十三、荧光强度测量...........................................................................................................................................64感谢丁香园战友:hbchendl提供教程畅想先锋-整理2010.07.011一、入门既然是处理图片，当然是先要打开一张要处理的图片嘛。在你开始学习使用IPP之前，我假定你是会初步使用office及photoshop等常用程序的。如果一点电脑常识也没有，那还是先学点简单的程序再回来玩IPP。因此我跳过了打开图片，copy、paste、象素的概念之类昀基础的知识与操作。这些用不着我来讲。这张照片中的黄色部分是免疫组化染色的阳性表达成分。处理目标是通过测量图片中黄色部分的黄度来反映相应蛋白表达的的量。对该图片进行观察，可以看到图片中主要有三种主要颜色，一是染成蓝色的细胞核，二是呈现出黄色的胞浆，三是细胞间的空隙区域，呈现出浅蓝色，是为背景。所以首先要把图片中呈现黄色的区域给挑选出来，然后才是测量这些挑出来的区域的各种测量参数，如面积、平均半径、周长、光密度等等。这部分需要挑出来进行测量的区域是我们昀感兴趣的地方，叫作AOI(areaofinterest)。AOI是IPP中昀有用昀重要的概念。如何能够准确地选取AOI就是使用IPP的关键操作。一旦准确地选取了AOI，下面的测量分析就好办了。在其他的测量软件中，选择这种不规则的区域一般只能用手拖着鼠标来画，而在IPP程序里，可以通过设置颜色范围让电脑来帮助你选择这些不规则区域，这样的选择就准确多了。可以说，使用IPP的要点就是灵活地使用各种AOI工具准确地把那些需要测量的区域给挑选出来。对不同的图片，需灵活地使用各种适当的AOI工具，先用昀简单的，当然，简单的工具只能作简单的事，就这张图片来说，用简单工具选黄色有点困难，我们先用它来选择蓝色的细胞核吧。点击measure---count/size,弹出分类测量窗口。2在窗口中选中manual,再点击selectcolor,弹出颜色选择窗口segmentation,这个工具是IPP昀有特色的颜色选取工具之一。用好这个工具是使用IPP的要点。3对于目标颜色鲜明的图片，用吸管工具是昀简单的。点一下吸管图标，在目标区域点一下，就可以选中该点的颜色，当然一下是不可能完全选中所需要指定的全部区域，可以在未选中的地方接着再点，这样多次选取，直到把想选中的区域全部选中为止。在这张示例图中，选中的蓝色细胞核部分被标上了红色。用红框圈起来的四个工具按纽分别是:吸管、撒消上一步操作、橡皮擦、全部清除。下在的小方框里则是吸管位置的选取颜色。图片中被标上红色的区域被定义为一个class,其中每一个独立的小区块被定义为这个class中的一个object。以此图为例，图中深蓝色的部分是细胞核，因此所有的细胞核都被选中成一个class，其中每一个细胞核就是一个object。4选取完AOI后，点击close回到count/size窗口，下一步就可以对选中的object进行测量操作了。点击count/size窗口中的measure菜单，点selectmeasure，这是选择要进行何种测量操作，在弹出的测量选择窗口左侧列出了各种可用的测量选项，昀常用的测量有:area面积density(mean)平均光密度diameter直径IOD(integratedopticaldensity)累积光密度在相应的项目上点一下，该测量项目就被选到中间的窗口中了，同时关于该测量的详细说明会显示在昀右边。如果想取消某个已选中的测量项目，则在左边窗口中该项目上再点击一下就可以了。5选好了待测量的区域，也指定了测量项目，就可以进行测量统计了，点击一下测量选择窗口的OK纽，关闭这个窗口，就回到了count/size窗口，再点击一下count按纽，就可以看到程序在进行测量，稍等几秒钟即可读取测量数据。分别点击count/size窗口中view菜单中的measurementdata和statistics，就分别弹出这两个数据窗口。前者是这个calss中每一个object的测量数据，后者是这些测量数据的统计参数，如总数、平均值、累加、标准差等。本例中得到的就是每个细胞核的面积、平均光密度值、直径、累积光密度值。统计数据则可得到这张图片中所有细胞核的平均面积、平均光密度值，平均直径、累积光密度值，当然还有细胞核的数目，就是所有object的数目。6测量数据转入EXCEL处理起来昀方便。只要在数据菜单中点file-DDEtoEXCEL。数据就传到EXCEL的sheet1里去了。在这个示例图片的统计数据中samples为图中所有细胞核的个数。第一列为area,其中的Mean值为各个核的平均面积，后面就是平均灰度、平均直径，这些是有意义的测量统计数值。但IOD却是SUM值更有意义。7订正：在上述操作中漏掉了一个重要步骤，就是要转换图象intensity格式。在默认的intensity格式中，是图片灰度，越黑数值越小，越白数值越大。而实际上我们测量的染色强度是光密度，染色越深，光密度值越大。如果不进行光密度单位的转换，测量的数值将完全是错误的。转换光密度单位的方法如下:点击:measure--carliberation--intensity，调出intensity校正窗口。然后在窗口中点new按纽，再点一下下面的stdopticaldensity选项，这时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线。然后还要点一下昀上面的system按纽。昀后点close关闭窗口。这样就把程序系统的灰度单位转换成了光密度单位。关于光密度较正的详细内容请参见第十帖及第十一帖。校正光密度单位的操作要在打开第一张图片后立即进行。将光密度单位设定为system之后就不必再对后面的每一张照片都进行光密度校正了。整个分析测量过程就是这样。当然，光知道这一点是远远不够的。在以上所述各个步骤中有许多技巧和方法能使测量数据更加准确合理。本人将另发帖子分别详细叙述。欢迎大家提问。此主题到此结束。IOD=density(mean)*Areadensity反映了阳性蛋白的浓度或强度，但IOD能反映选定区域的蛋白表达总量。一个典型的示例是:阳性样品切片中有大片的黄色区域，而阴性切片上只有少量的黄色区域，但是两者的黄色都很深。这样测量的阴性切片与阳性切片的黄色区域的densitymean就没有差异，差异在于其黄色区域的面8积上。如果是一个不典型的图片呢:一个黄色深但面积较小，另一个黄色浅却面积较大，那一个蛋白表达更强?这时用IOD就更准确了。二、AOI技巧（1）在IPP中，昀有特色，昀有用处的工具有两个。一个就是我们已经看过的segmentation工具，另一个是irregular工具。我们先看irregular工具。这是一个用来描绘不规则孤立对象边界的工具。图中一个个棕黄色形状是免疫组化染色的贴壁培养细胞，为了计算每个细胞的面