年8月过程工程学报

第8卷第4期过程工程学报Vol.8No.42008年8月TheChineseJournalofProcessEngineeringAug.2008收稿日期：2008−01−22，修回日期：2008−05−19基金项目：云南省自然科学基金资助项目(编号：2005E0068M)作者简介：邹平(1964−)，女，重庆市人，博士，高级工程师，主要从事生物和湿法冶金研究工作，Tel:[phone],E-mail:[e-mail].以黄铜矿为主的低品位硫化铜矿生物浸出体系中的细菌优势菌群邹平1,2，张文彬1，林连兵1，张兰兰1，雷霆2(1.昆明理工大学国土资源工程学院，云南昆明650039；2.云南冶金集团总公司技术中心,云南昆明650031)摘要：通过对以黄铜矿为主的低品位硫化铜矿中温硫杆菌生物浸矿体系的细菌优势菌群的研究，探讨了黄铜矿的细菌作用机理.采用9K培养基从细菌浸出矿浆中分离出了14株中温硫杆菌，其浸矿能力都弱于分离前的自然混菌菌种，在浸矿过程中自然形成的混菌群落中各菌株之间存在着协同效应.从上述菌株中随机挑选出氧化浸出能力有较大差异的YK8,YK12和YK14进行了16SrDNA克隆测序分析，显示它们与Acidithiobacillusferrooxidans的同源性均达到99%，为嗜酸氧化亚铁硫杆菌.由此说明该浸矿体系的优势菌群为嗜酸氧化亚铁硫杆菌，细菌氧化作用机理以直接作用为主.各纯菌株对Fe2+的氧化率存在较大差异，对菌浸矿浆用不同能源诱导培养后的混菌浸矿能力有显著变化.关键词：黄铜矿；优势菌群；生物浸出；16SrDNA；序列分析；嗜酸氧化亚铁硫杆菌中图分类号：TF803.21;Q938.1+5文献标识码：A文章编号：1009−606X(2008)04−0761−071前言嗜酸氧化亚铁硫杆菌A.ferrooxidans能利用硫化矿中的还原硫和亚铁两部分能源，具备了使矿物彻底氧化分解的生理、生化条件，在宏观上表现为直接作用.黄铜矿的细菌氧化作用以直接作用占主导地位，嗜酸氧化亚铁硫杆菌A.ferrooxidans是主导菌种[1].尽管国内一些研究者从下述不同角度证实了黄铜矿的细菌直接作用机理，但至今还没有人真正从黄铜矿生物浸出体系细菌种群结构的角度加以证明.李雅芹等[2]用中温硫杆菌对江西某地以黄铜矿为主的低品位硫化铜矿进行生物浸出，用扫描电子显微镜直接观察发现细菌优先附着于硫化物相表面(主要是黄铜矿CuFeS2和黄铁矿FeS2)，附着量随时间而增加，细菌生长速度及其对矿物的氧化速率与接触基质表面积正相关，从而认为细菌能通过直接接触氧化作用从以黄铜矿为主的低品位硫化铜矿中浸出铜；胡岳华等[3]研究了中温硫杆菌对黄铜矿的浸出行为，发现细胞色素C参与了S2−的氧化，从而间接证明了细菌对黄铜矿的直接作用；张维庆等[4]对中温硫杆菌氧化黄铜矿的直接作用(浸矿介质中只接种细菌)、间接作用(浸矿介质中有适量Fe3+，无细菌)及两者的藕合作用(浸矿介质中既接种有细菌，又有适量Fe3+)进行了研究；项拥军[5]结合德兴铜矿细菌堆浸厂的生产实践，发现溶液中总铁含量下降，而Cu2+含量却仍然上升，均表明中温硫杆菌对黄铜矿的直接氧化作用占主导地位.本工作研究以黄铜矿为主的低品位硫化铜矿生物浸矿体系的细菌优势菌群，进而从种群组成角度研究和证实黄铜矿的细菌直接作用机理.主要方法是采用9K培养基从菌浸矿浆中分离中温硫杆菌纯菌株，利用PCR扩增、基因克隆与测序等分子生物学技术对随机抽取的氧化浸出能力有较大差异的3株细菌进行了16SrDNA序列分析鉴定，从而对以黄铜矿为主的低品位硫化铜矿生物浸矿体系的细菌种群结构及细菌作用机理做出了明确判定.2实验2.1菌种和菌浸矿浆菌种：实验所采用的中温硫杆菌菌种是从云南某大型铜矿的酸性矿坑水中分离出来、再经以黄铜矿为主的低品位硫化铜矿驯化得到的浸矿效果优良的菌种⎯自然混菌菌种(Domesticbacteria).菌浸矿浆：将上述自然混菌菌种按10%(ϕ)接种量接种到100g/L的以黄铜矿为主的低品位硫化铜矿矿浆中，矿粉粒度180目(80µm).在温度30℃及pH2.0左右、搅拌速率150r/min的水浴中搅拌浸出12d，从中分离出中温硫杆菌并分析Cu2+含量.2.2细菌分离培养基9K液体培养基[6]：A液(g/L):(NH4)2SO43.0,K2HPO40.5,KCl0.1,MgSO4⋅7H2O0.5,Ca(NO3)20.01；去离子水800mL，硫酸调节pH为2.0,121℃高压灭菌20min.B液：FeSO4⋅7H2O44.78g/L，去离子水200mL，硫酸调节pH为2.0，孔径为0.22µm的滤膜过滤除菌.将灭菌后的A液与B液混匀后分装.9K固体培养基：A液+琼脂15g，与滤膜过滤除菌B液混匀后在70℃左右倒平板若干.762过程工程学报第8卷Starkey液体培养基[7]：C液(g/L):(NH4)2SO40.2,KH2PO40.5,CaCl2⋅2H2O0.25,MgSO4⋅7H2O0.5；去离子水1000mL，硫酸调节pH为2.3,121℃高压灭菌20min.硫粉10g，间歇灭菌.C液灭菌后将间歇灭菌的硫粉加入混匀即可.2.3细菌浸矿培养基采用无FeSO4⋅7H2O的9K液体培养基(0K培养基).2.4实验矿样实验矿样采自云南某大型铜矿以黄铜矿为主的低品位硫化铜矿矿床，主要金属矿物为黄铜矿和磁铁矿，其次是斑铜矿、黄铁矿和赤铁矿，有少量褐铁矿、铜兰及孔雀石等.脉石矿物以黑云母、长石、白云石、石英和绿泥石为主，其次是方解石和石榴石.其主要化学成分和物相分析结果如表1,2所示.表1矿样主要化学成分Table1MaincompositionoftheoresampleComponentCuSFeCaOMgOAl2O3SiO2Content(%,ω)0.890.923.924.52.887.4632.8表2矿样含铜物相铜含量分布Table2Cucomponentsofcopper-containingphaseanalysisoftheoresampleComponentContent(%,ω)Distribution(%)Sulphate0.00750.84Freeoxide0.00420.47Combinedoxide0.05506.18Secondarysulphide0.240026.97Primarysulphide0.580065.17Total0.89671002.5实验方法2.5.1菌浸矿浆中中温硫杆菌的分离与形态观察(1)9K培养基分离取10mL略微静置的矿样菌浸矿浆于盛有100mL9K液体培养基的三角瓶中，在30℃、转速150r/min及pH2.0左右的条件下，恒温摇床培养约3∼4d，待锥形瓶中液体呈红棕色，采用梯度稀释法，用pH2.0的0K培养基分别按10−1,10−2,10−3,10−4,10−5的稀释度进行稀释，取稀释液各0.1mL均匀涂布到9K固体培养基上，于30℃生化恒温培养箱中倒置培养约5∼6d，即可获得单菌落.将另一9K固体培养基培养皿外底部用记号笔平均划分为若干个小格，用牙签随机挑取上述单菌落分别点入各小格固体培养基中心，即做Masterplate，于30℃生化恒温培养箱中倒置培养.(2)Starkey培养基分离将略微静置的矿样菌浸矿浆10mL于100mLStarkey液体培养基中培养，通过检测培养液pH变化并结合镜检判断是否有细菌生长.待培养液pH降低及镜检出现大量细菌后，取60mL菌浸矿浆用作后续浸矿实验.(3)从菌浸矿浆中分离的细菌形态观察经革兰氏染色后，在NikonE200光学显微镜下观察细菌形态并拍照.通过离心分离矿粒和细菌，将细菌样品用戊二醛固定，涂布干燥后，再用导电胶贴于圆形贴片上，喷镀金属后，在扫描电镜下观察，拍照.2.5.2不同纯菌株对Fe2+氧化率的比较实验待Masterplate的14个菌落长出后，分别各取1/4接入盛有100mL9K液体培养基的三角瓶中，在pH2.0及30℃、转速150r/min下恒温摇床培养，3d后开始检测各菌株的Fe2+氧化率，之后定时同时检测各菌株Fe2+氧化率，直至实验结束.2.5.3不同纯菌株和混合菌株的浸矿实验纯菌株菌种活化：分别接入相同菌量各纯菌株于盛有100mL9K液体培养基的三角瓶中，在pH2.0及30℃、转速150r/min下恒温摇床培养3d后待用.人工混菌：取三纯菌株YK8,YK12,YK14的9K培养液各20mL配制成60mL浸矿菌种液.自然混菌(Domesticbacteria)：经以黄铜矿为主的低品位硫化铜矿长期驯化而成的混合菌群在100g/L实验矿样培养基中活化3~5d后取60mL备用.浸矿方法：配制600mL0K培养基，加入60mL菌种液和60g实验矿样矿粉，30℃下pH2.0及150r/min水浴搅拌浸出12d，定重，过滤，滤液分析Cu2＋含量.2.5.4菌株的分子鉴定方法(1)菌株基因组DNA的提取将菌浸矿浆低转速(离心力800~1200g)离心去除绝大部分矿粒，再高转速(离心力6000g)离心收集菌体细胞，用pH8.0的TE缓冲液多次洗涤沉淀，然后将处理后的细胞用基因组抽提试剂盒(购自上海生工生物工程技术有限公司)提取菌株基因组DNA.具体操作步骤按照试剂盒附带的说明书进行.(2)PCR扩增对已提取的纯菌株基因组DNA，利用16SrDNA的一对通用引物[8]进行16SrDNA序列的PCR扩增.扩增引物序列如下：正向引物：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′(对应E.coli序列位置为8∼27)，反向引物：5-ACGGCTACCTTCTTACGACTT-3(对应E.coli序列位置为1492∼1512)，由英俊生物技术有限公司合成.PCR反应体系(50µL)：10×Ex-Taqbuffer5µL,2.5mmol/LdNTP3µL，引物各50pmol,Ex-TaqDNA聚合酶(5U/µL)0.25µL，模板DNA约10ng，以去离子水补加至50µL.PCR扩增程序：94℃预变性4min，进行30次循环，94第4期邹平等：以黄铜矿为主的低品位硫化铜矿生物浸出体系中的细菌优势菌群763℃变性45s,50℃退火45s,72℃延伸90s，然后72℃延伸10min.(3)PCR产物的克隆与测序16SrDNA的PCR产物经胶回收试剂盒(购自北京百泰克生物技术有限公司)纯化后，用Invitrogen公司生产的TOPOTA试剂盒克隆，通过菌落PCR扩增检测转化产物，克隆产物的测序由北京三博远志公司完成.(4)序列分析将所测16SrDNA序列提交GenBank，通过Blastn进行序列同源性检索分析.选取基因库中相似性较高的菌株，利用Mega3.1软件进行系统进化树的构建.3分析方法3.1细菌对亚铁氧化活性的测定用重铬酸钾法测定溶液铁含量，氧化活性以细菌的Fe2+氧化率(%)表示：Fe2+氧化率(%)=(C0−Ct)/C0×100%,式中，C0,Ct为溶液中Fe2+的初始浓度和终浓度(g/L).3.2矿样中铜浸出率的测定浸出率通过分析矿样的铜品位和浸出液的铜离子浓度来计算.浸出液Cu2+浓度分别用原子吸收光谱法或碘量法测定，前者测定低浓度，后者测定高浓度.铜浸出率(%)=CV/(0.01ρW)×100%,式中，C为浸出液Cu2+终浓度(g/L)，V为浸出液体积(L)，W为矿样质量(g)，ρ为矿样铜品位(%).3.3pH测定采用精密pH计或精密pH试纸检测.4结果和讨论4.1菌浸矿浆中中温浸矿菌的分离与细菌和菌落形态特征实验矿样菌浸矿浆涂布后平板培养3∼4d，有白色针尖状菌落长出，继续培养2d左右，菌落成为黄色针尖状，直径小于1mm，菌落形态见图1，扫描电镜观察YK12菌株的菌体形态如图2所示.该菌株细胞形状为长杆状，长度约1.20∼2.10µm，宽度约0.47∼0.62µm.图1菌株在9K固体培养基上的菌落形态图2YK12菌株形态的扫描电镜照片Fig.1Co