鹅肝酱中脂肪酸检测方法的研究

鹅肝酱中脂肪酸检测方法的研究张国蓉1，刘有志，刘安军，陈伟伟，曹东旭（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津300457）摘要︰为了优化鹅肥肝及鹅肝酱中脂肪酸的检测方法，通过比较脂肪酸甲酯化的5种不同处理方法，得到了较优的样品处理方法。该方法为盐酸甲酯化︰样品用15mL氯仿︰甲醇（2︰1）提取脂肪，再用15mL1mol/LKOH-乙醇皂化，在皂化物加入30mL4％盐酸-甲醇溶液甲酯化，得到甲酯化样品。实验结果证实此法确实最佳。关键词︰鹅肝酱；气质联用；脂肪酸；甲酯化中图分类号︰O623.61；TS295.3文献标示码︰AStudyontheMensurationofFattyAcidinGooseLiverCatsupZhangGuo-rong,LiuYou-zhi，LiuAn-jun，ChenWei-wei，CaoDong-xu(Collegeoffoodengineeringandbiotechnology,TianjinScienceandTechnologyUniversity,Tianjin300457,China)Abstract:fortheoptimizationofthedetectivemethodsofthefattyacidingoosefattyliverandgooselivercatsup.Thebettermethodofdealingwiththesampleisachivedthrough5differentdisposedmethodsforfattyacidmethylesterification.Themethodishydrochloricacid-methylesterification:firstlythefatwasdistilledfromsampleby15mLchloroformandmethanol(2:1v/v),thensaponificationwith15mL1mol/Lpotassiumhydroxide-ethanol.Atlastgotthesampleofmethylesterificationthroughplus30mL4％hydrochloricacid-methanolintosaponificativesolutiontomethylesterification.theresultapprovedthatthemethodwasthebest.Keyword:gooselivercatsup,GC-MS,fattyacid,methylesterification0引言鹅肥肝是一种高级营养食品，质地细嫩、味道鲜美、营养丰富，鹅肝酱具有防止心脑血管疾病发生的功效[1]。鹅肝中含有大量的脂肪酸，而其中多为不饱和脂肪酸，约占65%--68%。鹅肥肝中的脂肪酸有肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸、油酸、亚油酸等，其中亚油酸是一些动物生长中不可缺少的一种酸，亚油酸和一些该系列的更不饱和的脂肪酸是生物膜的重要组成和关系到某些酶系统的活性的不可缺少的成分，研究证明亚油酸在油脂运输中起重要作用。其他不饱和脂肪酸在不同程度上对心脑血管疾病有一定的预防作用[2][3]。目前，对脂肪酸的检测的方法有很多，可利用气相色谱检测脂肪酸[4]和利用气质联用检测脂肪酸[5]，也有利用近红外反射光谱分析技术检测脂肪酸[6]。气相色谱检测和气质联用检测脂肪酸类似，前者需要标准品定性分析，且可准确分析脂肪酸定量，后者不需标品就能定性分析含量。脂肪酸特别是长链脂肪酸（12碳以上）一般不直接进行气相色谱分析，其原因是脂肪酸在高温下不稳定，易裂解，分析中容易造成损失，需要转化为脂肪酸甲酯化来间接测定。脂肪酸甲酯可由脂肪酸与甲醇发生酯化反应制得．也可由油脂（甘油酯）1作者简介：张国蓉（1970-），女，天津市人，博士，1998-2001年美国克莱姆森大学获理学博士学位，2001-2004年在美国斯克普斯研究院进行博士后研究，现主要从事生物资源开发与利用方面的研究工作。直接与甲醇发生酯交换（醇解）反应制取。然后利用近红外反射光谱分析技术可大致分析推测脂肪酸性质，但现在已不常用。目前中国国内已有对该类物质检测的标准方法，其中多为气相色谱法，但因标准品价贵，且不易获得和保留而受到限制[7]。而使用GC-MS法，则不会受到此类因素影响，只要样品甲酯化完全，色谱分离效果优良，就能够有效的对样品进行定性分析[8][9]。在利用GC-MS法检测脂肪酸过程中，脂肪酸的甲酯化是其中最为关键的步骤，其甲酯化是否完全直接影响到样品中脂肪酸的定性和样品中脂肪酸相对含量的检测效果。本研究用GC-MS联用仪定性分析脂肪酸甲酯，同时采用内部归一化法进行定量分析，通过比较5种不同脂肪酸甲酯化的方法，旨在得到一种能使脂肪酸甲酯化较为完全的处理方法，优化鹅肝酱脂肪酸的检测方法。1材料与方法1.1试验材料︰鹅肝酱（西班牙及自制）1.2主要仪器与试剂︰GC-MS-QP2010型气相色谱-质谱联用仪（岛津）；E-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；XMTB恒温水浴锅（上海德兆仪器仪表有限公司）；超速生物冷冻离心机（德国KENDRO公司）；ESJ205―4型电子天平（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）；氢氧化钾、石油醚、盐酸、甲醇、乙醇、正己烷、氯仿、无水硫酸钠等试剂均为分析纯，生理盐水为医用试剂，去离子水，氮气（纯度为99.999%）。氯仿︰甲醇=2︰1（v︰v），1mol/LKOH-乙醇（5.6gKOH溶解在100mL乙醇），4%HCl-甲醇（4mL盐酸溶于100mL甲醇）。1.3GC-MS分析方法1.3.1样品前处理取300mg的鹅肝酱，加入氯仿︰甲醇（2︰1v/v）的15mL溶液中，再加入3mL生理盐水，匀浆。离心(2000r/min,5min)取氯仿层,旋转蒸发，除去氯仿,加入1mol/LKOH-乙醇溶液15mL，水浴加热回流60min，皂化后再次旋转蒸发，去除乙醇，用20mL蒸馏水分3次洗蒸发瓶，转移到分液漏斗中，再加入乙醚20mL，提取不皂化物2次。在水层中加入稀盐酸调整pH为2.0，使脂肪酸从肥皂中游离。用20mL石油醚提取脂肪酸2次。然后用无水Na2SO4干燥、保存。使用前用旋转蒸发器去除石油醚[12][14]。1.4.2样品甲酯化方法试验分别采用5种脂肪酸甲酯化方法1）硫酸甲酯化[10]2）盐酸甲酯化[11]3）BF3甲酯化[12]4）KOH甲酯化[13]⑤5）甲醇钠甲酯化[14]处理待测脂肪酸，用气相色谱与质谱连用仪进行检测，优选较理想的甲酯化方法。1）硫酸甲酯化取上述皂化物旋转蒸发去除石油醚，放入100mL茄型烧瓶中，加入30mL的5％硫酸-甲醇溶液，70℃水浴60min，反应冷却后加入15mL正己烷和5mL水，混匀，离心，水洗至中性。将正己烷层取出，Na2SO4干燥，氮气浓缩，待测。2）盐酸甲酯化取上述皂化物旋转蒸发去除石油醚，放入100mL茄型烧瓶中，加入30mL的4％盐酸-甲醇溶液，60℃水浴60min，后同①；3）BF3甲酯化取上述皂化物旋转蒸发去除石油醚，放入100mL茄型烧瓶中，加入30mL的14％BF3-甲醇溶液，80℃水浴30min，后同①；4）KOH甲酯化取上述皂化物旋转蒸发去除石油醚，放入100mL茄型烧瓶中，加入30mL的1M的KOH-甲醇溶液，50℃水浴15min，后同①；5）甲醇钠甲酯化取上述皂化物旋转蒸发去除石油醚，放入100mL茄型烧瓶中，加入30mL的0.5M的甲醇钠-甲醇溶液，50℃水浴15min，后同①。1.5GC-MS分析条件1.5.1GC分析条件色谱柱︰DB-5石英毛细管柱，30mm×0.25mm（内径）×0.25μm（膜厚）；进样口温度︰210℃，分流式进样，分流比20︰1，样流速1mL/min；色谱柱程序升温︰170℃保留4min，以2℃/min升至210℃，保留16min；载气为氮气，总流速70mL/min。1.5.2MS分析条件离子源温度200℃；接口温度200℃；检测器电压1.0kV；电离能量70eV；电离方式EI；测定方式︰全扫描；扫描范围︰40～500amu/s。2结果与分析2.1皂化时间和温度的选择甲酯化的实验发现，皂化温度和时间对结果的影响较大，温度低时间短，皂化不完全，测量结果偏低；温度过高，甲醇易挥发，又会影响到甲酯化。综合考虑，选择温度为60℃，皂化时间为60min。2.2鹅肝酱脂肪酸不同甲酯化方法的比较采用气质联用方法检测其中的脂肪酸。图1为利用5种甲酯化方法所能测到的脂肪酸种类个数示意图。787660123456789硫酸甲酯化盐酸甲酯化BF3甲酯化KOH甲酯化甲醇钠甲酯化甲酯化方法测得脂肪酸种类个数图15种不同甲酯化方法实验结果Fig.1theexperimentresultof5methodsofesterify将上述处理所得的样品进行GC-MS分析比较，实验结果证明，对进行鹅肝酱甲酯化，在方法规定的条件下②盐酸甲酯化使样品甲酯化较完全，因此实验选择此方法进行检测。产生上述结果的原可能是，根据物质的状态不同所用的甲酯化方法也不相同，如在水溶液采用KOH甲酯化或甲醇钠甲酯化，则极容易造成皂化物水解，鹅肝酱中脂肪酸存在状态为液状，因此图1中KOH甲酯化和甲醇钠甲酯化检测的结果较少，可能是由于水解造成的。另外，BF3甲酯化适合对中性物质检测，硫酸甲酯化和盐酸甲酯化适合酸性物质和在水溶液进行，但是BF3、硫酸、盐酸在甲酯化过程中的作用是催化剂的效果，根据不同物质所得的效果和速度不一样，BF3属于要在较短时间内完成实验，对时间要求较严，时间的长短影响其结果。硫酸、盐酸在鹅肝酱甲酯化过程中的催化不一样，所以才会出现甲酯化效果不一。2.3试验色谱图及数据按上述条件对西班牙鹅肝酱和自制鹅肝酱进行皂化和甲酰化，得到各样品中脂肪酸的总离子流图，见图2～3。采用面积归一化法得到定量结果，共设计3个平行实验，结果见表1。图2自制鹅肝酱脂肪酸总离子流图Fig.2theionicchromatogramoffattyacidofhome-madegooselivercatsupbyGC-MS图3西班牙鹅肝酱脂肪酸总离子流图Fig.3theionicchromatogramoffattyacidofespanolgoosefattyliverbyGC-MS表1不同鹅肝酱中脂肪酸的种类及相对百分含量（n=3）Tab.1thecategoryoffattyacidofgoosefattyliveranddifferentgooselivercatsupand%(n=3)自制鹅肝酱西班牙鹅肝酱序号脂肪酸相对含量%脂肪酸相对含量%1肉豆蔻酸C14:01.93±0.112棕榈酸C16:025.62±1.13棕榈酸C16:041.64±4.093棕榈油酸C16:12.59±0.124硬脂酸C18:08.75±0.145油酸C18:140.15±1.23油酸C18:158.36±3.116亚油酸C18:29.11±0.367亚麻酸C18:311.85±0.25由实验结果表1可知，该方法所得结果的变异系数均在10%以下，因此可以认为是较为可靠的检测方法。3结论通过比较脂肪酸的5种甲酯化化方法，找到了其中使脂肪酸甲酯化最完全的处理方法。将样品用15mL氯仿︰甲醇（2︰1）提取脂肪，再用15mL1mol/LKOH-乙醇皂化，在皂化物加入30mL4％盐酸-甲醇溶液甲酯化，得到甲酯化样品。该方法甲酯化较为完全，操作可行。目前，国内外文献对鹅肝酱中脂肪酸检测的研究较少，仅有C.Molette利用近红外反射光谱分析技术对鹅肥肝中的脂肪酸进行了推测，且仅仅检测出棕榈油酸等6种脂肪酸[7]，而运用本研究的方法不仅对鹅肥肝中的脂肪酸检测进行了较为全面的研究，对其脂肪酸甲酯化的方法进行了较为广泛的比较，得到适合鹅肥肝中脂肪酸检测的甲酯化方法，检测出鹅肥肝中的脂肪酸达到8种；且本研究第一次系统对鹅肝酱中的脂肪酸进行了检测，为后来研究者奠定了基础。参考文献︰[1]周敏,潘健存,王土长.鹅肝酱的