黑曲霉产植酸酶的条件

黑曲霉产植酸酶发酵条件的研究摘要：研究培养基组成和培养条件对黑曲霉液体发酵产植酸酶的影响。以植酸酶活力为评价指标，利用单因素试验和L9（34）正交试验考察摇瓶发酵条件下培养基组成，起始pH值、温度、接种量、装量、种龄、发酵时间对黑曲霉产植酸酶的影响。结果表明，最佳培养基组成为：麸皮5％，NH4Cl0.13％，MgSO4·7H2O0.1％,MnSO4·H2O0.07％,FeSO4·7H2O0.01％，KCl0.05％，KH2PO40.01％；最佳培养条件为：培养温度31℃，pH6.0，接种量14％，种龄72-84h，摇床转速为150r/min，发酵时间6d。在此条件下，植酸酶活力可达43.712U/mL。关键词：植酸酶；黑曲霉；液体发酵；正交试验StudiesonthefermentationconditionsofproducingphytasebyAspergillusnigerAbstract：ToinvestigatetheliquidfermentationforphytaseproductionbyAspergillusniger.Thesinglefactortestsandorthogonalexperimentwereemployedtoevaluatetheoptionalfermentationconditionsforphytaseproductionexperimentbyliquid-statefermentationwiththeoptimalconditions.Theresultsshowedthattheoptimalmediumconfentwereasfollows:wheatbran5％,NH4Cl0.13％,MgSO4·7H2O0.1％,MnSO4·H2O0.07％,FeSO4·7H2O0.01％,KCl0.05％,KH2PO40.01％;theoptimalfermentationconditionsforphytaseproductionwere:fermentationtemperature31℃,theinitialpH6.0,theinoculm14％,seedage72-84h,theshakespeed150r/min,thefermentationtime6d.Underthoseconditions,thephytaseactivityreached43.712U/mL.Keywords：phytase;Aspergillusniger;liquidfermentation;orthogonalexperiment1前言1.1植酸及植酸酶植酸(Phyticacid)，又称肌醇六磷酸，是植物籽实中磷的主要贮存形式。在谷物、豆类、油料等作物的籽实中，磷的基本储存形式是植酸磷，其含量高达种子干重的1％～3％，约占植物中总磷的60％～80％。但是以植酸磷形式存在的磷却因单胃动物体内缺乏能分解植酸(六磷酸肌醇)的酶而难以被吸收和利用，其利用率仅在0～40％，从而造成了许多问题。首先，因为饲料中的磷源不能被有效利用，必须在饲料中另外添加无机磷(主要磷酸氢钙)以满足动物对磷的需求；其次，植物性饲料中85％左右的磷没法被单胃动物吸收和利用，从而直接排出体外，粪便中大量的磷使水源和土壤遭受严重污染。再次，植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物胃肠道的消化过程中会与多种金属离子以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，使一些消化酶的作用受到抑制，多种微量元素和氨基酸的利用率下降，降低了动物对以上营养物质的生物利用率。第四，目前饲料生产中用于生产磷酸氢钙的原料是磷矿、石灰和硫酸，全球磷矿的资源有限，且生产1t磷酸氢钙成品就要排出约1t以上的废物(磷石膏)，大型磷酸氢钙生产企业一天的产量在数百吨以上，每天排出的废物数量更大，企业附近磷石膏堆积成垃圾山，磷石膏容易下滑而成为附近的安全隐患，而硫酸也造成严重的空气、水源和土壤的污染；另一方面，饲料中添加无机磷将造成磷源的浪费，饲料成本增加[1,2]。植酸酶是催化植酸及植酸盐水解成肌醇与磷酸的一类酶的总称，自然界存在很多能水解植酸盐的酶类，统称“植酸酶”。植酸酶广泛存在于动植物组织和微生物细胞中，在植物中主要存在于谷物和豆科植物的种子和花粉中，而在动物中主要存在于脊椎动物的红细胞和血浆以及哺乳动物的小肠内。产植酸酶的微生物有细菌、酵母和真菌等，饲料中使用的植酸酶主要来自真菌，比如黑曲霉(Aspergillussp．)，其生产的植酸酶被认为是活性最强的[3,4]。植酸酶按结构的不同主要可以分为三类霉菌及部分细菌来源的PhyA与PhyB、Bacillussubtilis来源的PhyC、玉米植酸酶[2]。3-植酸酶(EC.3.1.3.8)PhyA与6-植酸酶(EC.3.1.3.26)PhyB属于同一酶家族，它们具有一个共同的活性部位保守序列RHGXRXP，并且它们的酶活性不需要辅助因子(如：金属离子等)来维持[4]。PhyC是Kerovuo等[5]从Bacillussubtilis中纯化出来的植酸酶，该分子的三维模型近似于有6个叶片螺旋的基本形式。PhyC没有通常植酸酶活性中心的保守序列RHGXRXP，而且需要Ca2+维持催化活性及稳定性[6]。2008年2月，欧盟发出了磷资源的红色预警，我国专家称中国的磷资源也只能开采20年。世界能源危机加重，原料价格普遍上涨，环保压力日益昭显，这无疑为植酸酶的发展提供良机，科技的发展将促使植酸酶生产与应用进入一个新的发展时期。如何从“植酸酶之困”转变为“植酸酶之盛”，是每个从业者应该思考的问题。1.2植酸酶的分子改造和晶体分析1.2.1植酸酶的分子改造天然的植酸酶不可能在各个性质上都很优秀，所以对其进行基因工程改造，特别是对蛋白质中和活性相关的几个氨基酸的定点突变研究是有必要的。目前对影响植酸酶热稳定性、最适pH、活性的氨基酸残基进行了大量的研究，并获得的多个性质优秀的基因工程改造的植酸酶。（1）植酸酶分子的糖基化修饰蛋白质的糖基化修饰有助于提高植酸酶的热稳定性。Han等[7]把A.nigerphyA基因在P.pastoris中表达，重组phyA的分子质量变为95ku，比A.niger天然表达的phyA的分子质量(80ku)大19％，在糖基化水平上略有提高，最适温度变为60℃，比原酶的最适温度提高2℃。通过一定的方法去糖基化后，酶分子质量减为55ku，同时热稳定性也降低34％。设计新的表达载体使phyA基因在Saccharomycescerevisiae中表达，由于S．cerevisiae表达系统的高度糖基化作用，重组酶的分子质量达到120ku，比A.niger天然表达的phyA的分子量大50％。重组酶的最适酶促反应温度55～60℃，比原酶的范围更宽；未完全纯化的重组酶在55℃与80℃下分别作用15min之后，酶活分别保留95％和75％。而同样条件作用后的商品酶PhyA酶活保留分别为72％和51％。该重组phyA经去糖基化后，酶活只降低了9％，但酶的热稳定性大为降低，80℃加热15min．酶活损失40％。去糖基化后的分子质量变为50ku，与由其他宿主系统表达的基因相同但耐热性差的γ-phyA的分子质量相似。充分说明了糖基化程度对该酶热稳定性有重要影响。(2)植酸酶的定点突变对phyA的基因工程改造已经基本成熟。Tomschy等[8]通过比较分别来自A．niger菌株NRRL3135和T213中不同活性的两个植酸酶，发现12个不同的氨基酸中第297号残基Arg突变为Gln的定点突变导致了植酸酶与底物结合能力下降，从而引起了活性的降低。Tomschy等[9]对A.fumigatus中与最适pH相关的多个极性氨基酸残基(Gln27、Serl40、Aspl41、Gly277、Tyr282)进行了研究，初步确定了其在pH和活性方面的作用。Mullaney等[10]将来源于A．niger的phyA进行Glu300Lys点突变。获得了pH4.0和37℃下活性提高了56％的植酸酶。彭日荷等[11]以烟曲霉中耐高温植酸酶基因phyA为基础，通过定点突变将部分密码子替换成毕赤酵母的偏爱密码，得到的重组子经过高密度发酵。其表达量比原始基因提高13倍，并有很好的耐热性。谷维娜等[12]对A.fumigatus来源植酸酶的Q23L和Q23LG272E进行突变研究，结果发现突变酶Q23L在pH5.5的比活性由51U/mg提高到109U/mg，突变酶Q23LG272E在pH3.0～4.5和pH6.5～7.0时的稳定性比Q23L有所提高。近年来，对细菌植酸酶的改造也有了系统的研究，现在对细菌植酸酶的改造大多针对E．coli的appA。Rodriguez等[13]将appA和其三个多位点突变的突变体在Pichiapastoris表达，发现突变体Cys200Asn/Asp207Asn/Ser211Asn虽然糖基化没有增强，但其植酸酶活性在多个方面得到了提高。(3)植酸酶的同序概念同序概念是对一组同源蛋白质的氨基酸序列进行比较，以一定的标准程序计算出各氨基酸序列的共有序列。人工合成同序列基因后重组表达。Lehmann等[14，15]把同序概念这种方法应用在真菌植酸酶家族含13种不同子囊菌类的序列，进行同序比较计算，设计合成了同序植酸酶基因fcp，构建表达载体pFP，在H.polymorpha中表达出同序植酸酶-1。同序植酸酶-1的最适温度为71℃，而亲代植酸酶的最适温度为45～55℃，增加了16～26℃，同序植酸酶-1Tm为78℃，比亲代植酸酶增加了15～22℃。而催化性质与大多数亲本植酸酶相似。经定点突变发现在同序植酸酶-1中有5个氨基酸Y31、P225、M342、F346、Y372，表现增加同序植酸酶的热稳定性，两种残基F296、A384不稳定。Lehmann等[16]在上述研究的基础上，通过增加更多的真菌植酸酶序列到组合中去。这些组合用于计算出两种同序植酸酶氨基酸序列，即同序植酸酶-10和同序植酸酶-l1。同序植酸酶-10比同序植酸酶-1Tm和最适温度分别表现7.4℃和9.0℃增加。通过定点突变检测，8个位点氨基酸残基的替换(E35A、D174N、E244D、R268I、R306H、S341T、A356K、G381A)，和l1个位点氨基酸残基的替换(E35A、D46K、D174N、T191L、E199T、E244D、R268I、R306H、S341T、A356K、G381A)可增加植酸酶的热稳定性，将这些突变分别增加到同序植酸酶-1中，产生同序植酸酶-1-thereto(8)和同序植酸酶-1-thermo(11)。同序植酸-1-thereto(8)Q27T和同序植酸酶-1-thereto(11)Q27T比同序植酸酶-1Tm增加6.7℃和10.5℃。Q27T突变对植酸酶的热稳定性几乎没有影响。(4)杂合植酸酶用杂合酶的方法可将同源植酸酶的相同部位的二级结构单元进行交换，产生杂合植酸酶，提高植酸酶的热稳定性。Jermutus等[17]根据A.niger植酸酶晶体结构，在A.terreus植酸酶的表而α螺旋(66～82区域)被相应A.niger植酸酶置换，导致杂合酶蛋白A(phyA)热稳定性改善，与A.niger相似，而酶活性未变。其原因在于两个不同来源的植酸酶在分子表面仅螺旋中氨基酸改变S58Y、T70L、A78V导致疏水相互作用，增加热稳定性。同源蛋白稳定性的不同是由于许多在进化中分散在整个序列中单点突变引起的。通过用更稳定或较不稳定相互作用的同源片段改变具很小稳定性或更多不稳定的相互作用的元素能引起稳定性的改善。(5)结构延伸突变结构延伸突变是在蛋白质的C端上连接一段随机肽段。从而改变蛋白质的结构，达到改善酶性质的目的。吴琦等[18]在植酸酶C端增加了来源于表达载体序列的13个氨基酸残基，使融合表达植酸酶其最适反应温度高达75℃，比出发菌株植酸酶的高15℃，比非融合表达植酸酶的高25℃；其耐热性也显著提高。90℃处理10min后的残留酶活性