您好,欢迎访问三七文档
实验一:大肠杆菌表达载体的构建及融合蛋白诱导表达生命科学技术学院2010年6月黑曲霉的优化培养总DNA或RNA的抽提PCR或RT-PCR扩增xynB基因目的基因的TA克隆质粒pMD-xylBEcoRI+XhoI双酶切凝胶回收试剂盒回收目的片断xynB乙醇沉淀回收线性化片断大肠杆菌表达载体pET-28(a)+酶连酶连产物转化E.coliDH5挑取转化子并抽提质粒验证表达质粒(PCR及酶切验证)28S18S重组表达质粒转化E.coliBL21挑取重组子,用菌落PCR方法验证IPTG诱导促使目的大量蛋白表达细胞破碎及蛋白抽提目标蛋白的纯化蛋白质浓度测定--Bradford法目标蛋白的鉴定—Westernbiotting融合蛋白诱导表达流程图XylBCK100mMIPTG1mlLB+Kan1-I1+I2+I3+ICk+I2-I3-ICk-I37℃,O/N37℃,2.7h37℃,2.7h37℃,O/N30℃,4h28℃,4h1mlLB+Kan3ul150ul3ul3ul3ul50mlLB+Kan•IPTG100mM使用浓度0.1mM•Kan100mg/ml使用浓度50μg/ml•PBS缓冲液:137mMNaCl2.7mMKCl10mMNa2HPO410mMKH2PO4试剂及缓冲液:3×SDS缓冲液:187.5mMTris-HCl(pH6.8,25℃)6%w/vSDS30%甘油0.03%w/v溴酚蓝GelStainingBuffer(每100ml):考马斯亮蓝250mg甲醇45ml乙酸10ml水45mlGelDestainingBuffer:甲醇100ml乙酸100ml加水至1000mlSDS-PAGE胶:30%聚丙烯酰胺10%SDS1.5MTris-HClpH8.80.5MTris-HClpH6.810%过硫酸铵(现配)TEMEDTris-甘氨酸电泳缓冲液25mmol/LTris250mmol/L甘氨酸(电泳级)(PH8.3)0.1%SDS可配成5×贮存液备用,在900ml去离子水中溶解15.1gTris碱和94g甘氨酸,然后加入50ml10%(w/v)的电泳级SDA贮存液,用去离子水补至1000ml。操作步骤1:(小规模诱导-筛选正确表达克隆子)1、从平板上挑取1个pET28-xylB/BL21转化子接种于装有2mlLB/Kan(Kan浓度50ug/ml)培养基的PA瓶中,37oC,250rpm,培养过夜;2、取过夜培养物按1%接种量分别转接二个装有2mlLB/Kan的PA瓶中,37℃培养约2小时40分钟;3、培养结束后,分别向其中一个瓶加入IPTG(终浓度0.1mM)并标记为“+I”,另一瓶不加IPTG标记为“-I”,28℃培养,250rpm,约4小时后收集菌体;4、从“+I”、“-I”培养瓶中各吸取1ml菌液于两个标有“+I”、“-I”的1.5ml离心管中,离心收集菌体,10000rpm、RT、1分钟,去上清,加入80ul缓冲液和40ul3×SDS上样缓冲液悬浮菌体,-20℃保存备用。5、取前面保存菌体(加入1×SDS上样缓冲液),置沸水5分钟(破细胞),然后置室温;6、在室温以10000rpm离心1分钟,取上清10-20ulSDS-PAGE蛋白电泳检测。附:SDS-PAGE胶的制备及蛋白质电泳:12%分离胶配制(5ml):水1.6ml30%聚丙烯酰胺2ml1.5MTris-HCl(pH8.8)1.3ml10%SDS0.05ml10%过硫酸铵0.05mlTEMED0.002ml制备SDS-PAGE胶分离胶配制时,过硫酸铵和TEMED先不加,将制胶板跟电泳槽装配好,制胶板凹面朝向自己方便注胶,然后加入过硫酸铵和TEMED,将胶液混合均匀后注入制胶板中,再加入一定量水饱和正丁醇去除气泡。放置30分钟,待胶完全凝固,去除正丁醇。然后配制积层胶。5%积层胶配制(2ml):水1.4ml30%聚丙烯酰胺0.33ml0.5MTris-HCl(pH6.8)0.25ml10%SDS0.02ml10%过硫酸铵0.02mlTEMED0.002ml积层胶制作方法跟分离胶制作相似,混合均匀后注入胶板,缓慢的插入梳子,静置30分钟,胶凝固后取出胶板,撕掉胶条,拔去梳子,再将胶板凹面背向自己装好电泳槽。缓慢向内槽倒入Tris-甘氨酸电泳液,使其没过凹槽,向外槽倒入与内槽持平的电泳液。•点样:所有的样品和蛋白Marker点样前都要沸水浴5分钟使蛋白质完全变性。一般的点样量为10-20ul。•点样完毕后即可开始电泳,先以80伏电压跑15-20分钟,蛋白质通过积层胶后,更换到120伏,待溴酚蓝接近分离胶底部后停止电泳,取下胶板,小心撬开胶板割取分离胶,放入染色皿中,加入一定染色液(没过胶面即可)。置于摇床上染色30-45分钟。•染色完毕后,回收染色液,加入脱色液,摇床脱色数次,前面几次可以时间较短,第一次约10分钟,依次时间稍微延长,最后一次可以过夜脱色。蛋白质电泳1、挑取1个正确表达目标蛋白的转化子接种于装有2mlLB/Kan(Kan浓度50ug/ml)培养基的PA瓶中,37oC培养过夜;2、按1%接种量接种于50mlLB/Kan(Kan浓度50ug/ml)中37℃培养约2小时40分钟,OD600=0.4-0.6;(前两步与操作步骤1相同)3、培养完毕后,向三角瓶中加入IPTG(100mM)50μl,使培养液中IPTG终浓度为0.1mM;28℃诱导培养,250rpm,约4小时后收集菌体;4、吸菌液1ml于1.5ml离心管中,另取20ml倒入50ml离心管中,离心收集菌体,6000rpm,4℃,10分钟去除培养基,加入2ml1×PBS缓冲液悬浮菌体,然后分装于2个1.5ml离心管中,10000rpm,离心2分钟,去上清,-20℃保存备用。操作步骤2:(大规模诱导-大量表达目标蛋白)实验二:大肠杆菌细胞破碎及蛋白浓度测定1、取出保存的诱导后的细胞(10ml),在冰上缓慢融化后,加入1mlPBS缓冲液;2、置冰上用超声波破碎细胞,将超声波发射探头插入菌液中,开始超声,10sec/次,间歇15sec(避免过度产热),重复数次(一般5-6次)直至溶液变清亮;所有过程均需在冰上进行;3、在4℃、13000rpm离心20分钟,可溶性蛋白存在于上清液中,不溶性蛋白存在于沉淀中;4、取上清液于另一干净的1.5ml离心管中,取40μl上清液测定总蛋白的浓度。采用BSA法测定蛋白浓度(Bradford,1972),首先作好标准曲线,然后将样品测得的OD在标准曲线上比较后获得样品蛋白质浓度。方法:1、完全溶解BSA蛋白标准品(5mg/ml),用PBS将标准品稀释成100-500μg/ml的溶液2、分别取40μL的不同浓度的溶液加入到1mL考马斯亮蓝试剂中,摇匀,室温反应3-5min后,在595nm处测定光吸收值。3、以光吸收值为横坐标,标准蛋白含量为纵坐标,绘制标准曲线。蛋白浓度标准曲线的绘制蛋白浓度标准曲线y=1452x+10.777R2=0.9914010020030040050060000.10.20.30.4吸光度浓度(μg/ml)1、取出保存的诱导后的细胞(10ml),在冰上缓慢融化后,加入1mlPBS缓冲液;2、置冰上用超声波破碎细胞,将超声波发射探头插入菌液中,开始超声,10sec/次,间歇15sec(避免过度产热),重复数次(一般5-6次)直至溶液变清亮;所有过程均需在冰上进行;3、在4℃、13000rpm离心20分钟,可溶性蛋白存在于上清液中,不溶性蛋白存在于沉淀中;实验三:表达蛋白的纯化4、细胞破碎上清液中,加入Ni-NTA树脂柱,在4℃下结合1h,每5分钟摇动一次;然后5000r/min离心1min移除上清液;5、加入10mmol/L咪唑(imidazole),50mmol/LpH7.5磷酸缓冲液(PBSbuffer),在4℃条件下洗涤30min,弃上清;重复洗涤3次,保留Ni-NTA柱;6、加入250μl100mmol/L咪唑(imidazole)、50mmol/LpH7.5磷酸缓冲液(PBSbuffer)洗脱液,在4℃条件下洗涤30min后5000r/min离心1min,用移液器小心收集上清(应尽量避免吸到离心管底部的Ni-NTA柱),置于新的1.5ml离心管中,-20℃贮存备用。实验四:表达蛋白的鉴定-western杂交操作步骤1蛋白质电泳•取-20℃保存的纯化好的蛋白样品(洗脱收集的上清)50μl,用PBS十倍稀释;取50μl稀释液,加入25μl3×SDS上样缓冲液,沸水水浴5分钟;•领取一管(每块胶)GST蛋白样品作为阴性对照•领取一管(每块胶)xylB蛋白样品作为阳性对照•各样品在室温以10000rpm离心1分钟,取上清10-20ulSDS-PAGE蛋白电泳。操作步骤2蛋白质的半干式电转移(戴手套操作)•将蛋白胶的积层胶切除(当胶上的样品较少时,不含目的蛋白的胶应都切除,使剩下的胶块尽可能小),然后浸入Towbinbuffer中平衡;•预先准备专用的滤片2张(或18张滤纸)和1张硝酸纤维素滤膜,其大小都应与凝胶大小吻合;用铅笔在滤膜一角做好标记;•将1张滤片(或9张滤纸)在Towbinbuffer中浸润后放置在电极上(如用9张滤纸则应逐张叠放整齐),用玻璃棒挤出所有气泡。(具体摆放顺序见下图)•于Towbinbuffer中浸润硝酸纤维素滤膜,然后置于滤纸/片上,排出气泡;•然后将平衡好的蛋白胶置于硝酸纤维素滤膜上,排出气泡;•再依次将另外9张滤纸(1张滤片)在Towbinbuffer中浸润后放置在蛋白胶上。•加上阴极电板,25V电压转移40分钟。•转移完成后,取出NC膜,在TBS漂洗5min,置入丽春红染液中染色,出现蛋白条带后,用自来水漂洗1min,用铅笔标记处蛋白质Marker的位置,然后加入TBS漂洗至颜色消失;9层滤纸-电转缓冲液9层滤纸-电转缓冲液阳极(+)阴极(-)Trans-BlotSDwithGelSandwich操作步骤3膜的封闭•用含有5%脱脂牛奶的TBS-T封闭NC膜(含有0.1%吐温20的1倍的TBS),在室温条件下孵育1至2小时(推荐在4℃条件下孵育过夜);•用TBS-T漂洗:15分钟,1次;5分钟,2次。•在室温条件下,将NC膜转入含有1%脱脂牛奶和合适稀释度的一抗的TBS-T溶液中(1:1000),孵育1至2小时;•用TBS-T漂洗:15分钟,1次;5分钟,2次。操作步骤4一抗杂交操作步骤5二抗进行杂交•在室温条件下,将NC膜转入含有1%脱脂牛奶和合适稀释度的二抗的TBS-T溶液中(1:5000),孵育1小时;•用TBS-T漂洗:15分钟,1次;5分钟,3次。•用TBS漂洗:5分钟,3次操作步骤6DAB(3,3’-二氨基联苯二胺)显色检测加适量显色液至将膜浸没,观察,出现清晰的条带(最多5分钟)即可加入蒸馏水终止反应。TowbinBuffer:25mMTrispH8.3192mMglycine20%methanol10×TBS缓冲溶液(1L)Tris-Base24.2g,NaCl80g,pH7.6显色液(10ml):DAB6mg0.01MTris-HCl(pH7.6)9ml0.3%CoCl21ml30%H2O210ul缓冲液配方:第一组,第二组,第三组,第四组配YPD液体培养基3L葡萄糖20g,酵母提取物10g,蛋白胨20g,pH6.5定容至1L分装20ml/250ml三角瓶,75瓶200ml/500ml三角瓶,7瓶第五组,第六组,第七组,第八组配BMMY液体培养基4L酵母提取物10g,蛋白胨20g,酵母氮碱3.4g,硫酸铵10g,用pH7.0的0.1M的磷酸钾缓冲液定容至1L。(pH7.00.1mol/L磷酸钾缓冲液:1mol/LK2HPO461.5ml,1mol/LKH2PO438.5ml,定容至1L,调节pH,定容至1L)分装50ml/250ml三角瓶,75瓶第九组,第十组,第十一组PA瓶100个,50ml离心管100个,洗好包好,灭菌250ml三角瓶200个洗好500ml三角瓶50个,试剂瓶20个
本文标题:原核表达实验
链接地址:https://www.777doc.com/doc-1931803 .html