高效液相色谱法测定植物油中苯并芘的不确定度分析

高效液相色谱法测定植物油中苯并（α）芘含量及其不确定度分析摘要目的：对高效液相色谱法测定植物油脂中苯并（α）芘含量的测量不确定度进行分析，为评价检测数据的准确性提供科学依据。方法：用HPLC法测定植物油中苯并（α）芘的含量，并根据《测量不确定度评定与表示》(JJF1059—1999)中有关规定评估其不确定度。结果：取样量2.00g时，测定植物油中苯并（α）芘含量为(100.00±6.42)μg/kg。结论：本方法适用于高效液相色谱法测定植物油中苯并[α]芘的不确定度评定。关键词：测量不确定度；高效液相色谱法；苯并（α）芘；植物油UncertaintyEvaluationofDeterminationofBenzo[α]pyreneinVegetableOilwithHPLCAbstractObjective:Toanalyzethemeasurementuncertaintyofdeterminationofbenzo[α]pyreneinvegetableoilwithHighPerformanceLiquidChromatography,andtoprovideascientificbasisforevaluatingthedetectionaccuracy.Methods:Wedeterminatedthecontentofbenzo[α]pyreneinvegetableoilwithHPLC,andevaluatedtheuncertaintyofthemeasurementaccordingtoJJF1059-1999.Results:Thebenzo[α]pyrenecontentwas(100.00±6.42)μg/kginvegetableoil，whenweRepeatedlydeterminatedthesample(weighed2.00g).Conclusion:ThismethodisapplicabletotheuncertaintyevaluationofHPLCdeterminationofbenzo[α]pyreneinvegetableoil.Keywords:measurementuncertainty;performanceliquidchromatography;benzo[α]pyrene;vegetableoil苯并（α）芘（Benzo(a)pyrene，BaP）是一种强致癌物质，食品植物油的理化指标中规定苯并（α）芘的含量要低于10μg/kg[1]。高效液相色谱荧光检测器法是测定苯并芘的一种常用的方法。本文按照GB/T24893-2010的方法来测定植物油中的苯并（α）芘[2]，根据《测量不确定度评定与表示》(JJF1059-1999)中有关规定对其测量不确定度进行了分析[3]，并对该检测方法的不确定度进行评估，给出不确定度，来评价检测结果的质量。1实验方法1.1仪器与试剂安捷伦1260高效液相色谱仪配荧光检测器，TDL-5000B型离心机，Millipore超纯水器，涡旋混合器，氮吹仪，超声波清洗仪，Waters公司的oasisHLB(6cc/200mg)WAT106202萃取小柱，Waters公司的sep-pakflorsil(6cc/1g)WAT043390净化小柱，乙腈，四氢呋喃，甲醇，正己烷，二氯甲烷，为Dikma纯试剂，丙酮，甲苯为优级纯。苯并（α）芘标准溶液（0.2mg/ml，溶于二氯甲烷，安瓿瓶装）由美国accustandard公司生产。测定的环境条件：温度(20±5)℃，相对湿度≤75%。1.3检测条件色谱柱：watersPAHC18(46mm×150mm，5.0μm)；流动相：A：乙腈，B：水，等度洗脱（A/B=90/10），流速：1mL·min-1；柱温：25℃；每个样品分析时间是15min，自动进样，进样体积：20μL；检测器：荧光检测器，检测波长：Ex=303nm，Em=425nm。1.4样品处理测定参照GB/T24893-2010的高效液相色谱荧光检测器法进行[2]，处理后样液上机分析，采用外标法单点定量。2测量不确定度的评估测量不确定度的评估程序主要有以下5个步骤：确定数学模型；分析直接测量分量各自的合成标准不确定度；计算最终测量值的合成标准不确定度；计算扩展不确定度；正确表示最终测量值结果。以下按照这5个步骤对本次实验的测量不确定度进行评估。2.1分析测量数学模型苯并（α）芘的含量计算公式为：AcVX=Asm式中：X为试样中苯并（α）芘的含量(μg/kg)；A为样液中苯并（α）芘的峰面积；c为标准溶液中苯并（α）芘的含量(μg/kg)；V为样液最终定容体积（mL）；As为标准溶液中苯并（α）芘的峰面积；m为试样的质量（g）。2.2不确定度的来源分析从测定过程和确定的数学模型分析，苯并（α）芘含量测定的不确定度主要来源于：标准物质u(S)、样品峰面积的测定u(As)、样品称量u(m)、定容体积u(V)、样品处理操作过程u(P)的差异等几个方面。2.3不确定度的评定2.3.1标准物质的不确定度标准物质不确定度包含标准溶液不确定度、标准储备液和标准工作液配制过程引入的不确定度。2.3.1.1标准液的不确定度评定苯并（α）芘标准溶液证书提供的信息，该标准溶液的不确定度是±0.3%，按正态分布考虑，包含因子k=3，属B类评定，则有相对标准不确定度为：u标物=0.3%/3=0.0012.3.1.2标准储备液配制过程产生的不确定度评定标准储备液配制过程是用1mL分度吸量管取1ml苯并（α）芘的标准溶液放入50ml容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至50mL，质量浓度为4μg/mL。该过程使用的玻璃量具，按JJG196—2006《常用玻璃量器检定规程》[4]的要求，均有相应的最大容量允差，按矩形分布考虑，k=3。1mL分度吸量管（A级）标准不确定度来源为：按检定证书给定其最大允许误差为±0.008mL，按照矩形分布换算成标准偏差为：u0=0.008/3=0.00462(mL)urel(0)=0.00462mL/1mL=0.0046250mL容量瓶(A级)的标准不确定度来源为：①按检定证书给定其最大允许误差为±0.05mL，按照矩形分布换算成标准偏差为：U1=0.05/3=0.0289(mL)urel(1)=0.0289mL/50mL=0.000577②充满液体至容量瓶刻度的变动性，通过重复测定进行统计，重复10次统计出标准偏差为0.11mL从而引起的相对不确定度：urel(n)=0.11mL/50mL＝0.0022。③实验室的温度波动范围一般为±5℃，20℃玻璃膨胀系数为2.5×10-5/℃，水体积膨胀系数为2.1×10-4/℃，甲醇体积膨胀系数为1.2×10-3/℃。容量瓶校准温度与使用温度不同引起的体积不确定值：ΔV=V1－V2=(α甲醇－α玻璃)×V×ΔT=(1.2×10-3－2.5×10-5)×50×5=0.29375(mL)按照矩形分布换算成标准偏差为：ΔV/k=0.29375/3=0.1696(mL)urel(t)=0.1696mL/50mL=0.0034以上3项合成得出urelv=2220.0005770.00220.0034=0.0041因此，标准储备液配制过程的相对不确定度：urel储备液=220.004620.0041=0.00622.3.1.3标准工作液配制过程产生的不确定度评定标准工作液配制过程是用1mL分度吸量管取1ml苯并（α）芘的标准储备溶液放入50ml容量瓶中，加入甲醇溶液溶解并定容至50mL，质量浓度为0.08μg/mL。本过程引入的不确定度与“2.3.1.2标准储备液配制过程产生的不确定度”相同，因此，标准工作液配制过程的相对不确定度：urel工作液=0.0062由上述2.3.1.1、2.3.1.2、2.3.1.3节中不确定度分量，得到苯并（α）芘标准物质的相对标准不确定度：urel(S)=2220.001+0.00620.0062=0.00882.3.2样品峰面积测量的不确定度评定此项包含了重复进样峰面积测量产生的不确定度、仪器数据处理系统引入的不确定度。2.3.2.1峰面积重复测量产生的不确定度这类不确定度属A类评定，由表1数据计算。由于测量次数较少，根据JJF1059—1999《测量不确定度评定与表示》[3]中，采用极差法进行评定，其中n=7，C=2.70。标准不确定度：uA=RC=(365－349)/2.70=5.93，峰面积重复测量的相对标准不确定度：urelA=AuA=0.0166。表1重复进样锋面积测量结果Table1Resultsofreplicatedeterminationforpeakarea进样次数1234567平均值峰面积（A）3493613653583523613533572.3.2.2仪器数据处理系统引入的不确定度根据仪器说明书，此液相色谱仪峰面积积分处理的最大误差为0.2%～1%，取1%，按均匀分布考虑，B类评定，峰面积的相对不确定度分量u1=1%/3=5.77×10-3根据安捷伦1260高效液相色谱仪测定进样器进样体积重复性＜0.5%)，按均匀分布考虑，B类评定，则此项相对不确定度分量u2=0.5%/3=2.89×10-3仪器数据处理系统引入的不确定度：u仪=2323 (5.7710)2.8910=0.0064由此，得到样品峰面积测量的不确定度：urel(As)=22 (0.0235)0.0064=0.01782.3.3称样量的不确定度评定根据称量使用的电子天平的检定证书，最大允许误差是±2.5mg，其置信水平99%，按正态分布考虑，包含因子k=3，则标准不确定度为u(m)=2.5mg/3=0.8333(mg)。样品称样量为2.00g，则其相对标准不确定度为：urel(m)=0.8333mg/2.00g=0.0004172.3.4样品处理后的总体积V的标准不确定度2.3.4.1容量瓶校准的不确定度样品处理后用1ml的A级单标线容量瓶定容，根据JJG196-90《常用玻璃量具检定规程》其最大允许误差0.010ml,按矩形分布考虑u1=0.010/k=0.010ml/3=0.00577（ml）相对不确定度u1rel=0.00577ml/1ml=0.005772.3.4.2实验室的温度波动范围一般为±5℃，20℃玻璃膨胀系数为2.5×10-5/℃，水体积膨胀系数为2.1×10-4/℃。1mL单标线容量瓶校准温度与使用温度不同引起的体积不确定度：ΔV=V1－V2=(α水－α玻璃)×V×ΔT=1.85×10-4×1×5=9.25×10-4(mL)按照均匀分布换算成标准偏差为：ΔV/k=9.0×10-4/3=5.34×10-4(mL)urel(Vt)=5.34×10-4mL/1mL=0.000534由以上两项合成得出urel(V)=220.005770.000534=0.005792.3.5试样处理操作过程产生的不确定度的评定此项包含了方法重复性测量的不确定度和加标回收率的不确定度。2.3.5.1重复性测量的不确定度该不确定度属A类评定，采用同一样品进行重复实验进行评估，步骤覆盖实验方法的全过程。实验依照GB/T5009.1—2003《食品卫生检验方法：理化部分总则》[5]规定，根据批号随机取样。测量数据见表2。表2植物油中苯并（α）芘的含量测量值水平Table2ResultsofreplicatedeterminationforBenzo[α]pyreneinarandomlyinspectedVegetableoil编号12345678Xi94.68101.12105.32100.2898.60101.1298.88100.00X100.00测量重复性的标准不确定度为uX=21()nn-1niiXX（）=1.1(μg/kg)最佳估计值为X=100.00μg/kg，则测量重复性的相对不确定度为：urel（X）=uX/X=1.1/100.00=1.