酶法合成7-ACA及头孢菌素类抗生素的研究进展

第1页共6页酶法合成7-ACA及头孢菌素类抗生素的研究进展芮菊1张体磊2山东鲁抗医药股份有限公司，山东济宁272100摘要头孢菌素类抗生素在制药工业中占据重要的地位，相关产品的酶法合成备受关注；酶法合成β-内酰胺类抗生素显著提高了合成效率，减少了三废排放。综述了近年来酶法合成7-氨基头孢烷酸（7-ACA）、头孢唑林、头孢氨苄、头孢拉定的合成方法。关键词头孢菌素；酶法合成；7-ACAProgressinenzymaticsynthesisof7-ACAandcephalosporinsRuiJu1ZhangTi-Lei2AbstractCephalosporinsantibioticsplayedanimportantroleinpharmaceuticalindustry.Enzymaticsynthesisβ-lactamantibioticscoulddeclinethegenerationofwasteandthecostofproductionremarkably.Thisreviewfocusesontherecentprogressesofenzymaticsemi-synthesisof7-ACA、cefazolin、cefalexinandcefradine.Keywordscephalosporin;enzymaticsynthesis;7-ACA酶法合成技术始于20世纪60年代末70年代初,经过30多年的发展,目前酶缩合反应技术、产品分离以及固定化酶技术等方面取得很大的发展,配套技术日益完善,具备了大规模工业化生产的条件,全球著名的ß-内酰胺抗生素生产厂家如荷兰DSM公司已有酶法合成的商品头孢氨苄、阿莫西林等产品面世。我国酶法合成研究起步并不晚,目前已有大规模工业化生产,与国外先进厂家差距较大。随着我国经济快速发展,人们对自身居住环境的要求,政府对环保的重视,酶法合成将是发展的必然趋势。7-氨基头孢烷酸（7-ACA）是生产头孢菌素类抗生素的重要母核，头孢菌素分子中由于都含有ß-内酰胺结构(图1)。它能抑制肽转肽酶所催化的转肽反应，使线性高聚物不能交联成网状结构，抑制粘肽的台成，从而阻止细胞壁的形成，导致细胞的死亡。NSORCONHRCOOHCH2X21345687图1头孢茵素的结构7-ACA和头孢菌素的合成工艺主要有化学法和酶法两种。化学半合成技术是目前通用的工艺，主要包括第2页共6页酰氯法和混酐法[1]，化学法合成存在着活化、缩合、保护和去保护的过程；合成过程长、步骤多反应条件苛刻产生大量的三废等弊端，而酶法合成工艺与化学法相比，由于具有许多优点，如：生产工艺简单，周期短；反应条件温和，pH接近中性；高度的区域和立体选择性以及无需保护和去保护过程，割除了化学合成中所需的毒害物质；劳动环境得到改善，减少了三废的排放。因此，用酶法实现7-ACA及头孢菌素的半合成体现了绿色环保工艺的各种优势。本文就近年来7-ACA两步酶法、一步酶法及头孢菌素抗生素酶法合成的进展进行了综述17-氨基头孢烷酸(7-ACA)的酶法合成7-氨基头孢烷酸是医药工业生产半合成头孢菌素的重要中间体,国内外在工业上多采用化学法由头孢菌素C钠（锌）盐脱去其侧链来生产。但化学法存在工艺复杂、成本高等问题,而且还会严重污染环境。与化学法相比,酶法裂解可以使生产过程大大简化(例如:发酵得到的头孢菌素C不需结晶就可用于酶解;生产过程中没有用到有毒溶剂;可省掉加保护剂和去保护剂等步骤),产品能够达到高收率、高质量,同时降低成本和减少污染。因此近年来人们着力进行酶法生产7-ACA的研究。1.1两步酶法制备7-ACA目前人们研究较多的是两步酶法制备7-ACA。首先,头孢菌素C在通氧气情况下被D-氨基酸氧化酶(D-aminoacidoxidase,DAAO)[2]催化,产生具有酮基的中间体(ketoadipyl7-aminocephalosporanicacid,keto-7-ACA)[4]和H2O2。这个中间体较不稳定,很容易被同时产生的H2O2化学氧化脱羧,转变成戊二酰基-7-氨基头孢烷酸(glutaryl7-aminocephalosporanicacid,GL-7-ACA),然后GL-7-ACA在GL-7-ACA酰化酶(GL-7-ACAacylase)的作用下脱去其侧链,生成7-ACA（见图2）。目前国内7-ACA大部分的生产厂家，如：山东鲁抗、河北石药、山西威齐达等已将7-ACA的生产线，由化学法转换为酶法，7-ACAD-氨基酸氧化酶和GL-7-ACA酰化酶国内也有厂家大批量生产。第3页共6页图2、头孢菌素C经两步酶法转化为7-ACA1.2一步酶法制备7-ACA虽然两步酶法制备7-ACA在生产成本和环境保护方面有优势，但是从头孢菌素C到7-ACA的转化率与化学法相比要低，而且DAAO催化反应难以控制。头孢菌素C酰基转移酶（CPCacylase）可以直接把头孢菌素C转变到7-ACA（不经过GL-7-ACA等中间产物），因此其转化率与化学法相当，而且能得到较高质量的7-ACA。利用CPCacylase生产7-ACA的一步酶法（One-stepenzymaticprocess）是非常新的7-ACA酶法工程，既具有化学法的优势（高转化率和纯度）也具有两步酶法的优势（高经济性和环境保护），目前韩国已成功开发出高质量的CPCacylase。CPCacylase第4页共6页2酶法合成头孢菌素类抗生素头孢菌素类药物是采用7-氨基头孢烷酸(7-ACA)或7-氨基脱乙酰氧头孢烷酸(7-ADCA)为原料制备得到。其母核上有两个侧链(图1)：C7位置上的酰胺键和C3位置上的乙酰氧甲基侧链，都可供化学改造之用。其与适当的酰基侧链连接，便可得到相应的半合成头孢菌素。现采用化学法生产的头孢菌素，大部分都可用酶法合成得到，展示了酶法台成头孢菌素类抗生素的广阔前景[3]。头孢噻吩、头孢氨苄、头孢唑啉、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢克洛、羟氨唑头孢菌素、头孢乙氰、头孢孟多、头孢吡硫等均有采用酶法合成的报道。用于合成头孢菌素类抗生素的酶主要为青霉素酰化酶，其产生菌主要有杆菌及单孢菌，如：巨大芽孢杆菌、无色杆菌、醋酸杆菌、大肠杆菌、粘性节杆菌、巴氏醋酸杆菌、混浊醋杆菌、假单孢菌、产黑假单孢菌、坏死单孢菌等。a-氨基酸酯水解酶也可用于头孢菌素的合成，其产生菌主要为单孢菌，如：铜绿假单孢菌、柑桔溃疡单孢菌。尽管这些产生菌所产生的酶均能催化相同的反应，但不同来源的酶，其底物专一性明显不同，活性中心也不同。下面将介绍一些头孢菌素抗生素的酶法合成。2.1“一锅法”酶法制备头孢唑林酶法合成β－内酰胺抗生素,一般一步反应在一个反应器中进行,近年来,有人将几步酶法反应(例水解缩合或缩合缩合等)在一个反应器中进行,这样不需分离中间体,简化了过程,有利于工业化生产,这将是酶法合成的趋势之一。新型化学酶法合成头孢唑林,通过D－氨基酸氧化酶、戊二酰化酶和青霉素G酰化酶催化作用,生物转化头孢唑林。以头孢菌素C为起始原料,在水溶性中,经三步酶法和一步化学法合成头孢唑林,不分离纯化中间体,每步酶法收率接近100%。先将头孢菌素C酶法脱乙酰基,然后由DAAO和GA催化,再由PGA固定化酶进一步催化酰化7－ACA,得到7－[(1H－四氮唑)－乙酰氨基]－3－乙酰氧甲基――3－头孢烷酸,最后与MMTD侧链化学法缩合得到头孢唑林。(图3)NNNNOOMe+NSOOAcNH2COOHTMG7-ACAPGANNNNONSOOAcHNCOOHMMTDCefazolin2.2酶法制备头孢氨苄在头孢氯苄酶法缩合反应中，所使用的酶基本上是采用固定化技术处理得到的固定化青霉素酰化酶，而早期使用的固定化细胞(细菌)等形态的酶，因其形态结构和性能方面的缺陷，已逐步被淘汰。目前所使用的图3酶法制备头孢唑林第5页共6页固定化酶，在生物工程菌的选育发酵、酶的提取、固定化载件的选择和固定化技术等方面都有了长足的进步．已经较好地解决了早期固定化酶在形态结构和性能方面的缺陷；同时由于对固定化酶催化反应机制和反应动力学方面的深入研究，因此，在头孢氨苄酶法合成中，固定化酶的使用寿命已经大大延长。头孢氨苄的酶催化缩合技术近年来的发展水平已相当令人满意。其中侧链与母核7ADCA的投料比例已经降低到1：1～2：1(分子比)之间；反应底物的浓度可以达到300～600mmo·L-1[4]；反应温度控制在5～35℃，7-ADCA的转化率可以达到93％以上。在酶法制备头孢氨苄技术中，产品分离与纯化的方法是一项关键性技术，由于所用的原料(苯甘氨酸衍生物、7ADCA)和产物头孢氨苄的理化性质相近，采用普通的方法难以达到分离提纯的目的，头孢氨苄与萘酚形成复合物的方法是一个比较简单可行的分离方法，反应体系中的头孢氨苄可以定量地与萘酚形成复合物而得到完全分离。采用β一萘酚作为复合剂，其非常适合有酶存在的反应体系，几乎是定量地产生头孢氨苄β一萘酚复合物。酶法合成头孢氨苄路线见图4CHNH2COR+NH2OSNCH3COOHCHNH2CONHOSNCH3COOH固定化酶β一萘酚CHNH2CONHOSNCH3COOHnOH酸/碱CHNH2CONHOSNCH3COOH苯甘氨酸衍生物7-ADCA头孢氨苄头孢氨苄β萘酚复合物头孢氨苄R=NH2OCH2OC2H32.3酶法制备头孢拉定头孢拉定(cephadine)，化学名为(6R,7R)-7-[(2R)-氨基-2-(1,4-环己二烯-1-基)乙酰胺基]-3-甲基-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂二环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸，是美国Squibb公司开发的头孢菌素类抗生素，1977年首次在日本上市，临床用于治疗敏感菌引起的支气管炎、支气管扩张感染、肺炎、肾盂肾炎、膀胱炎和尿道炎等。目前可用7-氨基-3-脱乙酰氧基头孢霉烷酸(7-ADCA)和2,5-二氢苯甘氨酸甲酯盐酸盐(DHME)为原料，在磷酸盐缓冲液中，经固定化青霉素酰化酶(PGA)催化合成头孢拉定[5]。见图5图4D-苯甘氨酸衍生物和7-ADCA酶法制备头孢氨苄第6页共6页图5头孢拉定的酶法合成3、展望尽管酶促合成头孢菌素类抗生素已取得了很大的进展，并且在某些产品的合成中已取得工业化应用，但仍然存在合成产率有待进一步提高等问题。在有机介质中，一些酶表现出超活性，采用合适的有机介质，可以提高酯类侧链的溶解度，减少侧链的水解，从而提高转化率。现代生物技术的发展和应用为绿色化学生产提供了新途径，头孢菌素类抗生素酶促合成方法的实现是一个例证。酶法生产头孢菌素类抗生素将提高抗生素生产中能源和原材料的使用效率，减少三废的排放满足了经济、环境和社会进步的需要。总之，酶法合成头孢菌素类抗生素，有着广阔的前景，相信随着研究的深入，其必能和化学法相竞争，并日臻完善。参考文献：[1]吴伟波，王旭，王娜，等。β-内酰胺类抗生素酶促合成新进展（J），有机化学，2006，26（3）：292～298[2]罗辉，李强，童忆舟，等。酶法生产7-氨基头孢烷酸的研究进展（J），现代化工，2002，22（12）：18～22[3]陈希杨，王普，应国清，等。酶法合成头孢菌素类抗生素的研究进展（J），浙江工业大学学报，2002，30（1）：53～58[4]方长明，陈舒明，刘爱红。头孢氨苄的酶法制备工艺研究进展（J），中国医药工业杂志，2002，33（1）：38～41[5]叶树祥，许成苗，王佳兵。固定化青霉素酰化酶合成头孢拉定的工艺研究（J），2007，38（9）：619～620