食品科学毒理学实验教案(2012)

实验一实验动物的一般操作技术一、实验目的学习食品毒理学试验中有关动物试验的基本操作技术，掌握实验动物的选择，性别鉴定，抓取方法，标记方法，染毒方法，生物材料采集和实验动物处死等技术。二、器材与试剂苦味酸酒精饱和溶液、美蓝溶液、0.9％的NaCl溶液托盘天平、电子天平、棉签、1mL注射器、灌胃器、烧杯、容量瓶、定量取血管、玻璃毛细管、鼠笼昆明种小鼠三、操作方法（一）实验动物的选择食品毒理学研究中，无论应用何种种属、品系的实验动物，都必须是健康动物。动物的选择，应重点检查下述项目。1.外观体形丰满，被毛浓密光顺，行动敏捷，反应灵活。2.眼睛明亮，瞳孔清晰，双侧等圆，眼内无分泌物，眼睑无肿胀、发红。3.耳耳道无分泌物溢出，耳壳无脓疮、糜烂。4.鼻无喷嚏，无浆性黏液分泌物。5.皮肤无创伤、脓疮、疥癣、湿疹。6.头颈部姿势端正。颈项歪斜提示可能存在内耳疾患，不能用于实验。7.消化道无呕吐、便秘、腹泻，粪便成形，肛门附近被毛洁净。8.神经系统无震颤、麻痹、运动失调，如有转圈运动或倒提时呈圆圈摆动，不能用于实验。9.四肢及尾四肢、趾及尾无红肿、溃疡。10.食欲及营养良好（二）实验动物的性别鉴定1.大鼠、小鼠主要观察肛门与生殖孔的间距，雄性间距大，而雌性间距小；雄鼠夏天或卧位可见睾丸，雌鼠腹部有明显乳头，大鼠6对，小鼠5对。（三）实验动物的抓取和固定实验前应了解动物的一般习性，正确抓取和固定动物，既要大胆，又要细心。1.小鼠的抓取方法先用右手抓取鼠尾部提起，置于实验台上向后拉，在其向前爬行时，用左手拇指和食指抓取小鼠的两耳和颈部皮肤，将鼠体置于左手手心中，以无名指按住鼠尾根部，小指按住后腿即可。右手则可进行灌胃或注射等操作。（四）实验动物的称重、编号和标记1.称重一般同一组内，同性别动物体重差异应小于平均体重的10％，组间同性别动物体重平均值相差应小于5％。2.编号和标记（1）染色法一般采用不同颜色的染料涂擦于动物不同部位的被毛染色，表示不同号码，此法适用于大鼠、小鼠和豚鼠。常用的染料有苦味酸酒精饱和液（黄色）、美蓝溶液（蓝色）或甲基紫酒精饱和液、0.5％中性红或品红溶液（红色）等。具体方法为：头部为1号，按顺时针方向，右前肢2号、右肋3号、右后肢4号、尾跟5号、左后肢6号、左肋7号、左前肢8号、背部9号；在相应部位涂染另一种颜色染料表示十位，两种颜色可编1~99号。（五）实验动物的染毒途径和方法1.经口染毒（1）灌胃将毒物不经口腔和食道，直接灌入胃内。急性毒性试验多用此法。具体方法：用带有灌胃器的适当容积注射器吸取所需的受试液（溶液、混悬液、乳液）备用。①小鼠保定，一手紧抓住耳后、颈部皮肤，用无名指、小指和大鱼际肌压紧尾根部。将动物固定成垂直体位，腹部面向操作者，使上消化道固定呈一直线。另一手持注射器，将针头由动物口腔侧插入，避开牙齿，沿咽后壁缓缓滑入食道。若遇阻力，可轻轻上下滑动探索，当感到阻力消失时，即将针头深入至胃部。如动物挣扎，应停止进针或将针头拔出，千万不能强行插入，以免损伤、穿破食道，甚至误入气管，导致动物立即死亡。进针深度一般是小鼠2.5～４cm。为验明灌胃针是否正确地插入胃部，可轻轻回抽注射器，如无气泡抽出表明已在胃中，可将受试液推入。（2）喂饲将受试化学物均匀拌入饲料或溶于饮水中，由动物自由采食。适用于染毒时间较长的毒性试验，如亚慢性和慢性毒性试验。（3）吞咽胶囊将所需剂量的受试化学物装入胶囊内，强制动物咽下。适用于易挥发、易水解和有异味的化学物，兔、犬、猫可用此法。2．注射染毒外源化学物的毒性研究中，根据试验目的和需要，可选择腹腔注射、静脉注射、肌肉注射、皮下注射等途径染毒。大鼠和小鼠经尾静脉注射，兔则经耳静脉注射。（六）实验动物生物材料的采集和制备毒理学研究中，常常需要采集动物的血液、尿液或组织，测定外源化学物或其代谢物的浓度。因此，生物材料的采集和制备是毒理学研究重要的基本操作技术。1．大、小鼠采血（1）鼠尾采血。适用于用血量较少的试验。固定动物后，将鼠尾浸入45~50℃温水，使尾静脉充血，擦干，用酒精棉球消毒。将尾尖剪去约2~3mm,拭去第一滴血，用血色素吸管（吸管内加抗凝剂与否，依试验需要而定）吸取定量尾血，然后用干棉球压迫止血。如需要多次采血，可用火棉胶涂封，下次采血时去掉火绵胶。鼠尾采血亦可用1ml注射器连接5~6号针头直接刺入尾静脉定量采血。（2）断头采血。操作者一手握住动物，另一手持剪刀或断头钳快速断头，倒立动物将血液滴入容器，注意防止断毛落入容器中。用于大鼠、小鼠。（3）摘眼球采血。动物倒立，使眼球外突充血，用小镊迅速摘掉眼球，将血液滴入事先备好的容器内。此法用于鼠类大量采血，仅使用一次。（七）实验动物的处死方法1.颈椎脱臼法多用于小鼠，一手按住鼠头，另一手抓住鼠尾猛力向后拉，使动物颈椎脱臼，立即死亡。2.断头法用于大鼠和小鼠。保定者一手按住鼠头，另一手握住背部，露出颈部，助手持大剪刀或断头器剪断颈部，使之死亡。此法不引起血浆皮质酮、儿茶酚胺升高，常用于血液及化学成分、组织酶测定。3.击打法适用于较小的动物。抓住鼠尾、提起，用力摔打其头部，鼠痉挛后立即死亡；也可用器具击打动物头部，使其致死。前法多用于小鼠，后法多用于大鼠和家兔。4.其他电击法、枪击法、微波法等。动物处死方法多种多样，原则是根据实验需要进行选择，同时尽量消除动物在试验过程中所致的疼痛和不适，遵守动物试验的职业道德。四、作业注明自己所选择实验动物的性别、体重及编号（画图说明）实验二小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的通过本次实验，学习和掌握小鼠骨髓多染红细胞（PCE）微核测定方法。二、实验原理微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。微核是指存在干细胞中主核之外的一种颗粒．大小相当于细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致，在间期细胞中可以出现一个或多个。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受到影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。所以，微核试验能检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。由于红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE细胞中，因此通常计数PCE细胞中的微核。三、器材与试剂1．器材手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布、带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片架、电吹风机、玻璃蜡笔、玻璃染色缸、2ml注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜、细胞计数器。2．试剂甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、小牛血清、生理盐水、Giemsa储备液（取Giemsa染料，甘油66ml，甲醇60ml。先将染料置于研钵内，加入少量甘油混合研细，再分次倾入剩余的甘油继续研磨，然后转移至烧杯内，盖上玻璃表面皿，置60℃水浴2h，取出待冷却后加入甲醇，混合静置2周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。该储备液存放的时间越长，染色效果越好。临用时用pH6.8磷酸盐缓冲液配制为10％的应用液、pH6.8的磷酸盐缓冲液。3．阳性对照物环磷酰胺。四、操作步骤1．试验动物及处理(l）动物选择：一般常用的试验动物为大、小鼠。以小鼠使用最为广泛，要求体重18g,7-12周龄。每组小鼠数量5只，雌雄各半。(2)染毒途径：根据研究目的或受试化学毒物性质的不同，可分别选用经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒途径。但原则上应尽可能采用与入体接触化学毒物相同的途径。(3）染毒次数及取样时间：研究证实化学毒物需在靶器官内蓄积至一定的浓度才具有致突变作用。波动范围可以达到24-72h。这就要求在接触化学毒物后设立不同的采样时间点。考虑到以上两方面的原因，建议采用多次染毒的方法。其中以4次染毒比较方便合理。即每天染毒一次，连续4天，第5天取样。(4）剂量选择：受试化学毒物的最大剂量除受溶解度大小所限外，应达到最大耐受量。一般情况下，应设3-5个或更多剂量组，剂量覆盖的范围要达到3个数量级以上。同时还应设立阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组可用环磷酰胺（40mg/kg）腹腔注射1次或2次。阴性对照组用等体积的溶剂。2．骨髓液的制备和涂片试验动物最后一次染毒后，按确定的时间用颈椎脱臼或麻醉的方法将其处死，四肢固定于解剖板，将腹中线被毛浸湿，剖开胸腹部，取下胸骨，擦净血污，用小型弯止血钳将骨髓挤于有一滴小牛血清的清洁载玻片上,混合均匀后推片。也可在动物处死后，迅速用手术剪将其两腿股骨取下，剔去肌肉，用生理盐水洗去血污和碎肉，剪去两端的骨髓，取骨髓滴在清洁的载玻片上，推片。阳性及阴性对照组按上述方法同时进行处理。3．固定将推好晾干的骨髓片放入染色缸中，用甲醇溶液固定15min，取出晾干。不能及时染色的涂片也应固定后保存。4．染色将固定晾干后的涂片，用新鲜配制的Giemsa应用液（Giemsa储备液l份加pH6.8的磷酸盐缓冲液9份）染色10-15min，然后冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干5．观察计数先在低倍镜下进行观察，选择分布均匀，染色较好的区域，再在油镜下观察计数．PCE细胞呈灰蓝色，正染红细胞（NCE）呈橘黄色。细胞中含有的微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出现一个或多个微核。计数1000个PCE中含微核的PCE数，并且计数200个细胞中PCE与NCE的比值。五、结果分析与评价每只动物为一观察单位。每组的雌、雄动物分别计算微核PCE的均值。雌、雄动物之间无明显的性别差异时可合并计算结果，否则应分别进行计算；正常的PCE/NCE比值约为1（正常范围为0.6-1.2）。如比值＜0.01，则表示PCE形成受到严重抑制，受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。阴性对照组和阳性对照组的微核发生率，应与试验所用动物种属及品系的文献报道结果或者是与研究的历史数据相一致。该试验的关键步骤是制作良好的骨髓涂片及优质的染色。六、作业计数PCE中的微核，微核率以千分率表示，并简要分析阴性对照组和阳性对照组的微核发生率不同的原因。实验二补充内容细菌回复突变试验1范围细菌回复突变试验包括鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验和大肠杆菌细菌回复突变试验。本标准主要规定鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验的基本技术要求，选择大肠杆菌进行细菌回复突变试验时应参阅有关文献。本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素的致突变作用，检验对象包括食品及其食品原料、食品添加剂、新资源食品、辐照食品、食品相关产品(用于食品的包装材料、容器、洗涤剂和用于食品生产经营的工具、设备)以及食品污染物。2术语和定义2.1细菌回复突变试验细菌回复突变试验是以营养缺陷型的突变体菌株为指示生物检测基因突变的体外试验。常用的菌株有组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌和色氨酸营养缺陷型的大肠杆菌。2.2碱基取代型基因突变指DNA多核苷酸链上某个碱基为另一个碱基取代，引起DNA碱基序列异常。2.3移码型基因突变指在DNA碱基序列中插入或缺失了一个或几个（除了3和3的倍数）碱基，于是按三联密码连续阅读的规则，该部位以后的密码子组成全部改变，指导合成的多肽链也全部发生改变。3原理/实验目的检测受试物对微生物（细菌）的基因突变作用，预测其遗传毒性和潜在的致癌作用。细菌回复突变试验利用鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌来检测点突变，涉及DNA的一个或几个碱基对的置换、插入或缺失。鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的试验菌株分别为组氨酸缺陷突变型和色氨酸缺陷突变型，他们在无组氨酸或色氨酸的培养基上不能生长，在有组氨酸或色氨酸的培养基上才能正常生长。致突变物存在时可以回复突变为原养型，在无组氨酸或色氨酸的培养基上也可以生长。故可根据菌落形成数量来衡量受试物是否为致突变物。某些致突变物需要代谢活化后才能使上述细菌产生回复突变，受试物要同时在有和没有代谢活化系统的条件下进行试验。4仪器和试剂4.1仪器实验室常用设备、低温高速离心机、低温冰箱（-80℃）或液氮罐、生物安全柜、恒温培养