BCA法测蛋白浓度(课件)

1实验二BCA法测定蛋白质浓度(BCAproteinconcentrationdetermination)耿磊生物化学教研室（301室）邮箱：[e-mail]2内容注意事项前言实验目的实验原理思考实验步骤3前言前言一、蛋白质的理化性质？（一）、蛋白质的胶体性质（二）、蛋白质的两性电离和等电点（三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚（四）、蛋白质的紫外吸收（五）、蛋白质的呈色反应4（一）、蛋白质的胶体性质前言蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1～100nm，为胶粒范围之内。蛋白质胶体稳定的因素：颗粒表面电荷、水化膜5（二）、蛋白质的两性电离和等电点蛋白质的两性电离蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。蛋白质的等电点(isoelectricpoint,pI)当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。前言6（三）、蛋白质的变性、沉淀和凝聚*蛋白质的变性(denaturation)在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，也即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质改变和生物活性的丧失。*蛋白质沉淀（precipitation）在一定条件下，蛋白疏水侧链暴露在外，肽链融会相互缠绕继而聚集，因而从溶液中析出。变性的蛋白质易于沉淀，有时蛋白质发生沉淀，但并不变性。*蛋白质的凝固作用(proteincoagulation)蛋白质变性后的絮状物加热可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中。前言7由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。前言（四）、蛋白质的紫外吸收8（五）、蛋白质的呈色反应前言蛋白质分子中的肽键及氨基酸残基的各种特殊基团，在一定条件下可以和某些化学试剂呈现一定的颜色反应，颜色的深浅与其浓度成正比。⒈茚三酮反应(ninhydrinreaction)⒉双缩脲反应(biuretreaction)3.Folin-酚试剂反应9前言二、蛋白质的测定方法？（一）紫外线吸收法（二）双缩脲法（三）Folin-酚试剂法（四)考马斯亮蓝结合法（五）改良微量凯式定氮法（六）BCA法10前言(一）紫外吸收法由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。优点：是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。缺点：准确度较差，嘌呤、嘧啶、核酸等容易干扰测定。11前言（二）双缩脲法H2N-CO-NH2+NH2-CO-NH2→H2N-CO-NH-CO-NH2＋NH3双缩脲双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。优点：操作简便、迅速、受蛋白质性质影响较小。缺点：灵敏度较差，本法测定蛋白质范围1-20mg；特异性不高12前言蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。优点：是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10－20倍，较双缩脲法灵敏100倍。缺点：其不足之处是此反应受多种因素干扰。（三）Folin-酚试剂法13考马斯亮蓝G-250染料在酸性条件下能与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰值从465nm变成595nm，溶液的颜色由棕红色变为蓝色，在595nm测定的吸光度值与蛋白质浓度成正比，故可用于蛋白质定量测定。优点：简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。缺点：用于不同蛋白质测定时有较大的偏差；大量去垢剂会使显色反应受到干扰；标准曲线有轻微的非线性；比色杯染色严重，影响重复性。前言（四)考马斯亮蓝结合法14蛋白质是机体内主要的含氮物质，而且氮元素的含量相当恒定，一般为16%，其他非蛋白质的含氮化合物所占得氮量甚微。因此，测定生物样品的含氮量，即可推算蛋白质含量。优点：准确度高，可测定不同形态样品。缺点：灵敏度低，适用于0.2～1.0mg氮，误差为±2％费时。前言（五）改良微量凯式定氮法15（六）BCA法碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+,Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。优点：操作简便、快速、灵敏度高，准确，试剂稳定性好，经济实用，抗干扰能力强。前言16•BCA蛋白质检测流程：前言17六种蛋白质测定方法比较方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法（Kjedahl法）灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为2％费时8～10小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双缩脲法（Biuret法）灵敏度低1～20mg中速20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏50～100g快速5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正前言18Folin－酚试剂法（Lowry法）灵敏度高≈5g慢速40～60分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高1～5g快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其max由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化BCA蛋白质定量检测灵敏度高，最小检测量达0.5g快速45分钟内完成测定碱性条件下，蛋白将Cu++还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。不受样品中离子型和非离子型去污剂影响此方法被广泛选用，操作简便，快速，准确，试剂稳定性好，抗干扰能力强检测不同蛋白质分子的变异系数远小于考玛斯亮蓝前言19•1.学习掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理。•2.掌握721型分光光度计的使用。•3.了解蛋白质测定的多种方法，并比较其优缺点。实验目的实验目的20实验原理•BCA(bicinchoninicacid,二辛可酸）碱性条件下，蛋白将Cu++还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。BCA分子式：实验原理21原理图：实验原理22实验步骤实验步骤（一）实验材料1、器材721型分光光度计、恒温水浴箱、移液管、试管2、试剂(1)试剂A:含1%BCA二钠盐、2%无水碳酸钠、0.16%酒石酸钠、0.4%氢氧化钠、0.95%碳酸氢钠，将上述液体混合后调pH至11.25。（2）试剂B：4%硫酸铜。（3）BCA工作液：试剂A100mL+试剂B2L，混合。（4）蛋白质标准液：准确称取150mg牛血清白蛋白，溶于100mL蒸馏水中，即为1.5mg/mL的蛋白质标准液。(5)待测样品。23实验步骤（二）操作表1BCA法测定蛋白质含量管号试剂（mL）空白管12345测定管标准蛋白溶液（1.5mg/ml）—0.020.040.060.080.1—蒸馏水0.10.080.060.040.02——待测样品——————0.1BCA工作液2.02.02.02.02.02.02.0蛋白质含量（μg）306090120150241、将上述各管混匀后于37°C保温30分钟，用562nm波长比色测定吸光度值。2、以蛋白质含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。3、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量，再计算出待测血清中蛋白质浓度（g/L)。实验步骤25注意事项1、紫外分光光度计的正确使用。2、试剂的准确量取，按操作表的顺序依次添加试剂。3、待测样品浓度在50～2000微克／毫升浓度范围内有较好的线性关系。4、注意安全，保护好仪器。注意事项26•1、试比较BCA法与双缩脲、Lowry法的异同。•2、BCA法常用于科研，其有哪些特点。思考27•1）预热仪器。•2）选定波长。•3）固定灵敏度档。一般测量固定在“1”档。•4）调节“0”点。•5）调节T=100％。•6）测定。•7）关机。紫外分光光度计的使用28下次实验：血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳预习要点：1、复习蛋白质两性解离。2、预习电泳的基本原理。3、结合几种蛋白质的等电点，为什么将点样端置于阴极？4、为什么跑在最前面是清蛋白？而跑在最后面是r-球蛋白？5、如何辨认各条带？6、请简要写出操作流程图。7、请写出计算公式。29欢迎大家提宝贵意见！