过氧化实验操作步骤

材料准备：幼苗培养时选取饱满的种子,经过10%次氯酸钠消毒后,于30℃恒温催芽3天,之后选取长势一致的种子播于96孔PVP板中,并置于盆中(长24cmX宽24cmX高10cm)。在RXZ-500C人工气候箱中进行幼苗培养。培养前1周放入水中培养,于第3周时置于木村B半营养中,于第4周时放入木村B全营养液中,将生长4周的幼苗置于20%PEG-6000中模拟干旱胁迫,分别处理5h、24h、72h,以不进行干旱胁迫营养液培养的幼苗为对照(CK)。为防止根系缺氧,用加氧设备定期加氧。人工气候箱白天温度设定为29°C,夜间设定为27°C,14h光照/12h黑暗,光强为220001x。胁迫结束后马上取样,取幼苗所有叶片和根,用银箔纸包好,放入液氮中迅速冷冻,然后保存于-80°C超低温冰箱中储存,用子生理指标的测定。试验设置3次重复,取样时每个品种取一盘,每20株为一次重复。酶类物质和非酶类物质1、抗氧化酶活性测定酶液提取:取样品0.25g于冰研钵中,加入5ml预冷的0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)(内含5mmol/LEDTA,2mmol/L抗坏血酸,2%聚乙烯吡咯烷酮),冰浴研磨成浆,在4°C10000g下离心30分钟,上清液用于超SOD、POD、CAT和APX活性测定。超氧化物歧化酶(SOD)活性测定:釆用氮蓝四唑法(Dhindsa等,1981)。在微烧杯中依次加入1.5ml,0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8),0.3ml130mmol/l甲硫氨酸(Met),0.3ml,750umol/L氮蓝四唑(NBT),0.3ml100umol/LEDTA-Na2,0.3ml20umol/L核黄素,0.05ml酶提取液,0.25ml蒸馏水,反应体积共3ml。在60umolphotonsm-2s-1的日光等下反应20min,同时在暗中和光下分别做2个对照。以暗对照调零,在560nm下测定吸光度,以抑制NBT还原的50%为一个酶活单位计算SOD活性。过氧化物酶(POD)活性测定:采用愈创木酌法(李合生,2000)。向比色杯中加入0.1ml酶提取液,然后2.6ml0.3%愈创木酚，用0.3mlO.6%H2O2启动反应,在470nm下测定连续3分钟内吸光度的变化,用每分钟每克样品鲜重的吸光度的增加值表示酶活性。过氧化氢酶(CAT)活性测定:参照部琦(2000)的方法,用蒸馏水调零。向比色杯中加入0.2ml酶提取液,再加入2.8ml0.06mol/LH202启动反应,立即测定240nm下连续3分钟内吸光值的变化,用每分钟每克样品鲜重的吸光度的降低值表示酶活性。抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定:参照Nakano和Asada(1981)的方法,用蒸懷水调零。向比色杯中加入0.2ml酶提取液,1.75ml0.05mol/L磷酸缓冲液(PH7.0),0.3ml1mmol/LEDTA,0.3mlmmol/L抗坏血酸,0.3ml蒸馏水,用0.3ml1mmol/LH202启动反应,立即测定290nm下连续1分钟内吸光值的变化,用每分钟每克样品鲜重的吸光度的降低值表示酶活性。谷肮甘肽还原酶(GR)活性测定:照KnSrzer等(1996)的方法,取叶片0.3g于冰冻研钵中,力口5ml预冷的100mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5,内含1mmol/LEDTA),在冰浴上研磨成匀浆,4°C12000g下离心30分钟,上清液即为酶提取液。在比色杯中加入0.2mL酶提取液,3ml碟酸缓冲液(pH7.5,含1mmol/LEDTA),0.1ml5mmol/L还原型谷胱甘肽(GSSG),最后用0.03ml3mmol/L还原型烟酰胺腺嘌呤二核昔酸磷酸(NADPH)启动反应,在340nm下测定连续3分钟内吸光度的变化,用每分钟每克样品鲜重的吸光度的降低值表示酶活性。脱氧抗坏血酸还原酶(DHAR)活性测定:照Doulis等(1997)的方法,取叶片和根0.2g于冰冻研钵中,加预冷的提取液(憐酸钾缓冲液Ph7.5,内含ImM乙二胺四乙酸EDTA,0.1mM聚乙二醇辛基苯基醚TritonX-100,2%聚乙稀吡咯烷酮PVP)5ml,在冰浴上研磨成匀浆,4。C12000g离心20分钟,上清液即为酶提取液。在比色皿中加入0.2ml酶提取液,2ml磷酸钾缓冲液(pH7.O),0.3ml25mmol/L还原型谷耽甘肽(GSH),0.3ml1mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),加入0.1ml2mmol/L脱氧抗坏血酸DHA)启动反应,在265nm下测定连续3分钟内吸光度的变化,用每分钟每克样品鲜重的吸光度的降低值表示酶活性。2抗坏血酸和谷胱甘肽含量测定抗氧化剂还原型抗坏血酸(AsA)和还原型谷胱甘肽(GSH)及其氧化产物氧化型抗坏血酸(DHA)和氧化型谷耽甘肽(GSSG)的含量釆用李忠光等(2003)的方法测定。抗坏血酸和谷胱甘肽的提取:称取样品0.25g,加入预冷的5%横基水杨酸2.5ml,充分冰预研磨,于4°C下20000g离心20分钟,将上清液分装,进行抗氧化剂含量测定。还原型抗坏血酸(ASA)和氧化型抗坏血酸(DHA)含量测定:取100uL上清液,加入24uL1.84mol/L三乙醇胺以中和样液,加入250uL50mmol/L磷酸缓冲液(pH7.5,内含2.5mmol/LEDTA),加入50uL10mmol/L二硫苏糖醇(DTT),25°C保温10分钟,使DHA还原为AsA,加入0.5%乙基马来酰亚胺50ul,混勻,以除去剩余的DTT,此时分别加入10%TCA,44%磷酸,4%2,2’-双吡啶(用70%乙醇配制),各200ul,混勾,加入3%FeCl3lOOul,混勻,4°C水浴60分钟,到时在525nm处测出吸光度。此法用来测定样品中总抗坏血酸(AsA+DHA)的含量。在AsA的测定中,把上述的DTT和乙基马来酰亚胺用等体积的蒸馆水替代即可。以5%磺基水杨酸为溶剂,用同样的方法制作AsA标准曲线。DHA含量为每个样品的总抗坏血酸含量与AsA含量的差值。还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量测定:取50ul上清液,加入5%磺基水杨酸50ul,然后加入24ul1.84mol/L三乙醇胺以中和样液,加入50ul,10%乙稀吡啶(用70%乙醇配制),25°C水浴60分钟,以除去GSH,到时加入706ul50mmol/L憐酸缓冲液(pH7.5,内含2.5mmol/LEDTA),加入20ul10mmol/L还原型烟醜胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)和80ul12.5mmol/L二硫硝基苯甲酸(DTNB),混勻,25°C保温10分钟,到时加入20ul50U/ml谷胱甘肽还原酶(GR),总体积为1ml,立即混勻,读出3分钟时的吸光度。此法用来测定GSSG含量,总谷胱甘肽(GSH+GSSG)含量的测定,把上述的乙烯P比唆用等体积的蒸懷水替代即可。以5%横基水杨酸为溶剂,用同样的方法制作GSSG标准曲线。GSH的含量为每个样品的总谷胱甘肽与GSSG含量的差值。脯氨酸含量测定釆用郝建军(2001)的方法进行测定。取样品0.5g,剪碎后放入具塞试管中,加入5ml3%的磺基水杨酸溶液,沸水浴提取10分钟。冷却后吸取上清液2ml,加入2ml蒸馆水、2ml冰醋酸及4ml酸性節三酮,充分摇匀,沸水浴中加热30分钟。冷却至室温,加入4ml甲苯,充分摇勻,以萃取红色产物。静置分层后,吸取上层甲苯,取上层甲苯于520nm下测定吸光度,根据用标准脯氨酸溶液所作标准曲线,计算样品中脯氨酸含量。脯氨酸含量(ug/g)=(标准曲线査得脯氨酸含量(ug)x提取液体积)/(样品重X测定液体积)丙二醛含量测定丙二酸含量测定参照Heath和Packer(1968)方法。取0.5g样品,加入3ml0.1%(w/v)三氯乙酸(TCA)溶液,研磨成勾楽,15000g离心20分钟,取上清液1ml加入4ml20%TCA(内含0.5%(w/v)硫代巴比妥酸(TBA)),于100°C水浴煮沸30分钟,冷却后10000g离心10分钟,取上清液测定532nm和600nm波长下的吸光度。丙二醛含量(umol/g)=(OD532-0D600)x反应液体积X提取液体积/(0.155X样品重量X测定用提取液体积)0.155为丙二醛的消光系数(umol/ml)。超氧阴离子含量测定超氧阴离子产生速率参照Elstner和Heupel(1976)的方法测定。取样品0.5g,加入3ml65mmol/L(pH7.8)磷酸缓冲液,冰浴研磨,4°C下5000g离心10分钟。取上清液0.75毫升,加入0.675ml65mmol/L(pH7.8)磷酸缓冲液和0.07mllOmmol/L盐酸经胺,摇勻,25°C水浴保温20分钟,然后加入17mmol/L磺胺0.375ml,摇勻,再加入7mmol/La-萘胺0.375ml,摇匀,25°C水浴20分钟,加入等体积(2.25ml)色素萃取液三氯甲烷,取粉红色水相(上层)测定530nm的吸光度,以NaNO2为标准曲线,计算超氧阴离子(O2-)产生速率。可溶性糖含量的测定:可溶性糖含量的测定参照李合生方法进行测定,取0.10g材料,加入10ml蒸馈水,塑料薄膜封口,于沸水中提取30min(提取2次),提取液过滤入25ml容量瓶中,反复漂洗试管及残渣,定容至刻度。取0.5ml提取液,加入0.5ml葱酮和5ml浓硫酸,充分震荡,立即将试管放入沸水浴中,逐管准确保温1min,取出后自然冷却至室温,以空白作参比,测定630mn波长下吸光度。可溶性糖含量=《（从回归方程求得糖的量/吸取样品液的体积）*提取液量*稀释倍数》/（样品鲜重*106）*100%可溶性蛋白含量的测定:可溶性蛋白含量的测定参照李合生方法进行,取鲜样0.5g,用5ml蒸馆水研磨成匀架后,10000r/min离心20min,取上清液1.0ml于试管中,加入5ml考马斯亮蓝G-250溶液,充分混合,放置5min后在595nm下比色,测定吸光度,并通过标准曲线査得蛋白质含量。可溶性蛋白含量(mg/g)=（查标准曲线蛋白质浓度*提取液体积）/（测定体积X鲜样xlOOO）在结构上，原花青素是由不同数量的儿茶素（catechin）或表儿茶素（epicatechin）结合而成。最简单的原花青素是儿茶素、或表儿茶素、或儿茶素与表儿茶素形成的二聚体，此外还有三聚体、四聚体等直至十聚体。按聚合度的大小，通常将二～五聚体称为低聚原花青素（简称OPC），将五聚体以上的称为高聚原花青素[1]（简称PPC）。