遗传学论文中文版

PTEN蛋白的减少和损失的表皮生长因子receptorgene突变的肺癌与自然耐吉(IRESSA)文摘•材料和方法•结果•讨论•引用•确认•数据和表ESSA)、表皮生长因子受体(EGFR)酪氨酸激酶抑制剂(TK),抗肿瘤活性的晚期非小细胞肺癌(NSCLC)设置。然而,在chemotherapy-naive晚期非小细胞肺癌患者,摘要的标准化疗方案未能提高生存。这些结果表明,需要提高靶向疗法的病人选择和组合依据。我们已经识别出的亚种群自然耐吉的腺癌细胞株,并分析了cDNA表达概况、EGFR基因的基因组状态和吉对信号通路的影响在这些细胞系以识别关键机制自然获得耐吉。Gefitinib-resistant亚种群显示增加一种蛋白激酶磷酸化(不是被吉),PTEN蛋白表达减少和损失的EGFRgene突变与父母相比细胞系。这些一种蛋白激酶和PTEN蛋白表达的差异并不明显的cDNA阵列配置文件。这些数据表明,(1)EGFRgene突变可能可能迷失在一些癌症细胞与其他额外的机制激活一种蛋白激酶,(2)PTEN或药理的重新对这些本构PI3K-Akt-pathway活动可能是一个有吸引力的治疗策略与吉抵抗癌症。关键词:吉,PTEN;一种蛋白激酶;表皮生长因子受体(EGFR)基因;突变;自然阻力因子受体(EGFR)是170kda的蛋白质组成的一个细胞外配体结合域,短跨膜域和胞内域与内在酪氨酸激酶(TK)活动(科恩等,1982;木匠和科恩,1990)。高表达EGFR在各种上皮恶性肿瘤,包括肺癌,已被证明发挥因果作用在疾病进展(Ozanne等,1986;Haeder等,1988)。因此,表皮生长因子受体是一种很有前途的分子治疗目标在不同肿瘤类型,包括肺癌。Gefitinib(IRESSA)3-chloro-4-fluoroanilino7-methoxy-6-(3-morpholinopropoxy)喹唑啉)是一种口服EGFR-TK抑制剂,抑制表皮生长因子受体信号(Rusch等,1993;所罗门等,1995)。第一阶段试验的吉耐火材料标准固体肿瘤化疗患者显示良好的耐受性和抗肿瘤活性的证据(轮渡等,2000;Ranson等,2002)。理想(IRESSA剂量评价高级肺癌)1和2是随机二期试验非小细胞肺癌(NSCLC)患者的耐火材料,以铂为基础的化疗。这些试验表明,吉是活跃和一般耐受性良好:反应率分别为11.8%和18.4,分别和主要的毒性是轻度或中度皮疹和腹泻(福冈等,2003;克里斯等人,2003)。完好无损(IRESSANSCLC试验评估联合治疗)1和2三期试验相比一线化疗有或没有吉在晚期非小细胞肺癌患者,并演示了类似的生存结果在治疗武器(Giaccone等,2004;Herbst等,2004)。这些数据表明,改善病人的选择和组合策略所需的最优效用的有针对性的治疗。EGFR-TK吉发挥抗肿瘤活性,但其抗肿瘤活性不显著相关肿瘤细胞表皮生长因子受体表达(贝利等人,2003)。最近,差异之间的频率激活表皮生长因子受体基因突变的可能性吉反应者和nonresponders被报道,这些表皮生长因子受体突变似乎预测敏感指标吉(林奇等,2004;部门等,2004)。我们检查敏感性吉在非小细胞肺癌细胞系使用麻省理工(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2、溴化5-tetrazolium)细胞增殖测定和识别父母腺癌细胞株,PC9,吉,敏感和两个亚种群,PC9/f9和PC9/f14,耐药。这些潜在的PC9由人工建立转移方法和耐吉因此获得自然,不吉。为了确定额外的关键分子参与吉抵抗,我们分析了档案利用cDNA表达阵列基因和基因组theEGFR地位在父细胞系和亚种群,并分析了吉的影响的下游介质EGF-mediated信号PI3K-Akt和Ras/MEK/较通路(OlayioyeTopof页面材料和方法•材料和方法•结果•讨论•引用•确认•数据和表细胞系MTT测定,我们分析了growth-inhibitory吉对九个非小细胞肺癌细胞株的影响:A549,活性,PC7,PC9,PC9/f9,PC9/f14和PC14腺癌细胞系,Lu65大细胞癌细胞系和LK-2鳞状细胞癌细胞系。PC9/f9(竹中平藏等人,2000)和PC9/f14(Gemma等,2001)是高度转移亚系PC9日本医学院建立了利用人工转移的方法。为了阐明耐吉的潜在机制,我们评估cDNA表达吉阻力概要文件和他们的关系。我们还专门检查的影响摘要PI3K-Akt和Ras/MEK/较通路PC9,PC9/f9和PC9/f14细胞。药物和生长抑制试验斯利康,曼切斯菲尔德,英国和溶解在二甲亚砜(DMSO)的体外研究。我们使用了colourimetric利用MTT测定(四唑染色试验)研究活动的吉非小细胞肺癌细胞系(Mosmann,1983)。细胞悬浊液(200μl1×105毫升−1)细胞被播种到井96井microtitre板和10μl药物解决方案(不同浓度)补充道。孵化后72小时37°C,20μl麻省理工的解决方案(5毫克毫升phosphate-buffered盐水中的−1)被添加到每个和孵化进一步4h37°C。离心后1500r.p.m。5分钟,媒介是200年从每个好,吸气μlDMSO溶液加入溶解甲瓒。IC50值定义为所需的浓度减少50%的吸光度(560海里)基于生存曲线。RNA分离、cDNA阵列杂交和杂交信号的分析胞总RNA分离线使用标准协议前面描述的(Gemmaetal,1996,1998)。从总RNA信使RNA被纯化孵化与oligo-dT-magnetic珠子(Toyobo有限公司日本大阪)。ElectorGene阵列系统(GeneticLab有限公司、札幌、日本)用于过滤器的cDNA阵列分析,如前所报道(Gemma等,2001)。在这个分析中,1300种人类DNA片段,包括癌症和drug-resistance-associated基因,以及管家和non-mammalian基因消极的控制,发现在复制一个过滤器。探测器是由反转录(逆转录酶,ReverTraAce(Toyobo有限公司日本大阪)),与一个随机9梅尔(Toyobo有限公司日本大阪)和5毫克的RNA多聚腺苷酸。公司的探针与生物素标记biotin-16-deoxyuracil三磷酸在互补脱氧核糖核酸的合成。20毫升的过滤器是preincubatedPerfectHyb(Toyobo有限公司日本大阪)30分钟68°C。biotin-labelled探针变性和添加到prehybridisation解决方案,一夜之间,过滤器被孵化68°C的杂交混合物。洗后,过滤器上的特定信号被检测到的成像High-Chemilumi-Detection工具包(Toyobo有限公司日本大阪)。CDP-Star衬底(美国Tropix,贝德福德,MA)作为化学发光底物,和化学发光图像过滤器被Fluor-S收购(Bio-Rad、大力神、钙、美国)。基因表达图像量化通过测量信号的强度使用Imagene(美国洛杉矶BioDiscoveryCA)和过滤器由ElectorGene发现系统分析了信号强度(GeneticLab有限公司、札幌、日本)。背景阈值设置水平三倍高于负控制。信号强度在正常与管家基因的表达相比,GAPDH和beta-actin(glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶)。三倍的差异基因表达的亚种群和父细胞系被认为是重要的,根据公司的建议(Toyobo有限公司日本大阪)。摘要对PI3K-Akt和Ras/MEK/较通路PC9,PC9/f9和PC9/f14细胞暴露于吉PC9/f9和PC9/f14细胞serum-starved和治疗各种浓度的吉(0、5、50、500和500ng毫升−1)2h后接触10ng毫升−1EGF(BA-53)(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国)为5分钟。免疫印迹分析区包含1%TritonX和1%NP40被加入到细胞在声波降解法POLYTRON均质器(KINEMATICA、Littau-Lucerne、瑞士)。溶菌产物是通过离心000r.p.m14岁。了20分钟,然后10μl溶解产物含有10μgSDS-polyacrylamide凝胶电泳的蛋白质分离(页面)。页面后,蛋白质被转移到硝酸纤维素膜和涂抹具有以下主要抗体:PTENA2B1(圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),和一种蛋白激酶,phospho-Akt(Ser473),人们MAP激酶和phospho-p38地图激酶(Thr180/Tyr182)(所有细胞信号技术、贝弗利,美国)。膜被孵化peroxidase-conjugated二级抗体和蛋白与发射极耦合逻辑检测免疫印迹检测试剂(Amersham,白金汉郡,英国)(Naishiro等,2001)和film-processorFPM100电影(富士照片电影)。这些图片被测量信号的强度量化使用NIH图像(ImageJ1.32j)。PTEN基因的基因组DNA分析聚合酶链反应因组DNA样本,PTEN基因的外显子都是单独放大与前文所述的聚合酶链反应(PCR)引物(Hosoya等,1999)使用AmpXLPCR基因kit(珀金埃尔默/罗氏,Branchburg,新泽西,美国)。基因组DNA分析聚合酶链反应条件如下:40周期在94°C40年代,60°C30年代和68年代在68°C,68°C8分钟紧随其后。每个反应混合物包含200×XL缓冲区,μMdeoxynucleotide三磷酸,1100μM毫克(OAc)2、0.5UrTthDNA聚合酶XL,0.3毫米的底漆(每一对之一)(Hosoya等,1999)和25ng的基因组DNA。聚合酶链反应产品放置在1.2%琼脂糖凝胶。经过电泳,凝胶进行分析。表皮生长因子受体基因突变分析reaction-single链构象多态性(PCR-SSCP)与前面描述的分析(吉玛,etal,1996年,1998年)。这三个外显子(18、19和21)EGFRgenePCR引物分别放大使用报道(林奇等,2004)。聚合酶链反应进行使用AMPXLPCR基因kit(当时公司/罗氏,Branchburg,新泽西,美国)如上所述。PCR反应混合物包含XL缓冲区包含1100μM毫克(OAc)2、200μMdeoxynucleotide三磷酸,0.1毫米的底漆贴上5-IAF(Amersham淀粉微球的生物技术,乌普萨拉,瑞典),0.5UrTth基因组DNA的DNA聚合酶和25ng。5-IAF-labelledPCR产物变性,在冰上冷却,装上中性6%聚丙烯酰胺凝胶有或没有5%(卷卷−1)甘油。电泳后,凝胶分析使用FluorImager595(Amersham淀粉微球的生物技术,乌普萨拉,瑞典)。与前面描述的DNA序列分析(吉玛,etal,1996年,1998年)。异常的乐队是由PCR进一步削减从凝胶和放大使用M13的测序引物序列(TGTAAAACGACGGCCAGT)添加到适当的PCR引物。测序反应进行,产品提纯并使用荧光自动测序音序器(当时公司/应用生物系统公司,促进城市CA,美国)。多色荧光原位杂交(FISH)分析中期准备从癌症细胞系细胞群ticolour-FISHVysion中期准备进行使用光谱探针根据制造商的指示(美国Vysis,,IL)。图像形象地表现了一个落射荧光显微镜(蔡司、Oberhochen、德国)和分析使用一个应用成像CytoVision工作站(纽卡斯尔、英国、美国)。总共20中期细胞在每个分组人口进行了分析。Topof页面结果•材料和方法•结果•讨论•引用•确认•数据和表摘要对体外细胞生长的影响50值九非小细胞肺癌细胞株,取决于利用MTT试验,总结inTable1。按照最小稳态浓度在临床试验报告(264ng毫升−1;0.59μM),PC9和A549对吉似乎敏感。PC9细胞系的两个亚种群,有趣的是,PC9/f9和PC9/f14,显示耐吉虽然父细胞系是敏感的。人类的高转移性肺腺癌细胞株,PC9/f9,成立