酶工程第四章.

第四章固定化酶与固定化细胞第一节概述第二节固定化方法第三节固定化酶性质第四节固定化酶反应动力学第五节固定化酶的应用一游离酶在应用中所存在的问题1酶在水溶液中参与反应，难以回收酶，导致应用生产成本高，而且应用过程难于连续化；此外酶蛋白残留给产物的分离纯化带来困难。2酶的稳定性一般较差，易受环境影响（物理因素、化学因素、生物因素），活力下降甚至失活。第一节概述二．固定化酶概况定义:凡限制在一定的空间范围内并能连续反复地使用的酶。发现：1916年Nelson和Griffin，骨粉吸附转化酶研究：1953年，Grubhofer和Schloith，重氮化树酯，羧肽酶，淀粉酶，蛋白酶，核糖核酸酶工业化：1969年千钿一郎，固定氨基酰化酶，D,L-氨基酸不溶于水——水不溶性酶，固相酶和固着酶1971年，第一届国际酶工程会议，“固定化酶”名称三固定化酶的优缺点优点缺点重复使用载体昂贵产物易于分离特性会发生改变稳定性提高部分酶活力丧失连续加工辅因子再生及多酶反应存在问题四固定化菌体用一定的方法对菌体或菌体碎片进行固定，直接应用菌体或菌体碎片中的酶或酶系进行催化反应。五固定化细胞定义：凡限制在一定的空间范围内，并能连续反复地使用的能进行生命活动细胞。五固定化菌体或细胞的优缺点优点缺点省去酶分离过程细胞内蛋白酶对辅因子再生及多酶反应所需酶的分解稳定性提高副产物细胞壁和膜阻碍底物111111111111111和产物的渗透、扩散1973年，日本在工业上成功固定化大肠杆菌菌体，利用菌体中的天门冬氨酸酶，连续催化反丁烯二酸为L-天门冬氨酸。第二节固定化方法一固定化方法：吸附法，共价结合法，交联法，包埋法二载体类型1来自于自然的有机载体优势:与酶有很好的相容性多糖类物质及其衍生物(多孔,亲水)纤维素及其衍生物(DEAE,CM)葡聚糖(Dextran)琼脂糖(agarose)淀粉(starch)壳聚糖(chitosan)蛋白质(明胶gelatin)2无机载体优势:高压稳定性硅载体:多孔玻璃;硅土矿物原料:粘土,斑脱土(火山灰分解成的一种粘土)3无机合成载体优势:化学及机械稳定性高离子交换树脂功能基团的共聚物三固定化方法1吸附法:通过弱的相互作用吸附到硅土,粘土,离子交换树脂表面,如离子键,氢键,疏水作用力及静电等.1）物理吸附定义：使用对蛋白质具有高度吸附能力的硅胶、活性炭、多孔玻璃、石英砂和纤维素等吸附剂，将酶吸附到其表面上使酶固定化的方法。优点：价廉，易操作易再生缺点：易泄漏，易受污染•静止法•反应器上直接吸附法•混合浴或振荡浴吸附法例：高岭士吸附胰凝乳蛋白酶;皂土吸附过氧化氢酶,－淀粉酶;纤维素粉吸附糖苷水解酶;火棉胶吸附木瓜蛋白酶，碱性磷酸酶，酯酶，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。2）离子吸附定义：酶蛋白在解离状态下因静电引力而固着于带有与酶蛋白电荷相反的离子交换剂上的固定化方法。主要缺点：离子强度增加或者介质pH，温度改变时，离子吸附不稳定，酶与载体解离。3）疏水吸附N－烷基（疏水）琼脂糖黄嘌呤氧化酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酯酶、脲酶（疏水性强）。4）亲和吸附伴刀豆球蛋白A（利用此蛋白与糖蛋白的专一性结合）－琼脂糖吸附糖蛋白。5）螯合吸附利用酶蛋白上的金属离子与载体基团的螯合吸附。2包埋法1）定义：将酶包裹于凝胶格子或聚合物半透膜微胶囊中的方法。该方法不需要化学修饰，反应条件温和，适合大多数酶，粗酶制剂，甚至完整的微生物细胞。2）根据载体材料和方法的不同，可分为格子型包埋法和微胶囊法。格子型包埋法常用凝胶：聚丙烯酰胺凝胶，琼脂糖凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶，明胶等。为防止包埋固定化后酶从凝胶中泄漏出来，凝胶孔径应控制在小于酶分子直径的范围内。因而对于大分子底物的进入和大分子产物的扩散出去不利。微胶囊法（半透膜包埋法）定义：将酶包埋在由各种高分子聚合物制成的半透性小球内，制成固定化酶。小球直径一般只有几微米至几百微米，称为微胶囊。3共价法定义：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法。优点；稳定性好缺点：反应条件激烈，操作复杂，控制条件苛刻，相对酶活力较低。4．交联法定义：借助双功能或多功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。第一篇报道是：戊二醛交联羧肽酶得到一种分子间交联的固定化酶双官能团能试剂：戊二醛，已二胺，顺丁烯二酸酐，双偶氮氮苯优点：结合牢固，可长时间使用缺点：交联法单用时，所得到的固定化酶，颗粒小，机械性能差，酶活性低。常与吸附法或包埋法联合作用，制备出酶活性高，机械强度又好的固定化酶或固定化菌体。第三节固定化酶性质一．稳定性储存和操作过程中稳定性增强，主要表现在：1热稳定性，2蛋白质水解酶的抗性，3变性剂的耐受性，4保存期延长。二．反应的最适温度最适温度比天然酶高。用CM-纤维素迭氮衍生物固定化的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度比游离酶高5～15℃。采用不同固定化材料，最适温度不同，如氨基酰化酶，天然酶最适温度60℃，分别用DEAE-葡聚糖凝胶、DEAE-纤维素固定化的酶的最适温度分别为72℃和67℃。三．反应的最适pH1载体性质2产物性质微环境最适pH载体（-）吸引H＋，pH↓偏高载体（＋）吸引OH-，pH↑偏低微环境最适pH产物（酸性）pH↓偏高产物（碱性）pH↑偏低四.底物特异性底物专一性：由于空间位阻效应，固定化酶对高分子量底物的活性降低，对低分子量底物的反应速率变化不大。五．酶活力活力回收：固定化酶活力/溶液酶活力;相对活力：固定化酶活力/溶液酶活力-残留酶活力酶经固定化后大部分活力下降！六米氏常数Km固定化酶的表观米氏常数Ｋｍ随载体的带电性能而变化。固定化酶催化系统是一种非均相的反应系统。以微胶囊包埋法为例，反应过程包括:①底物从反应液主体移向载体表面(底物外部扩散);②从载体表面移向酶、作用位点(底物内部扩散);③底物被催化生成产物;④产物从反应位点移向载体表面;⑤产物再移至反应主体液。第四节固定化酶反应动力学一固定化对酶反应系统的影响1．空间效应1)构象效应：酶在固定化过程中，由于存在酶和载体的相互作用，从而引起酶空间结构的改变，导致酶催化底物转化能力的改变。2)位阻效应（空间障碍）：因载体的存在，给酶的活性部位或调节部位造成了空间障碍，使酶的活性下降。2．分配效应1）固定化酶和主体溶液组成固液非均相体系微环境：固定化酶颗粒附近的环境宏观体系：主体溶液体系2）分配效应：由于固定化酶载体的亲水性、疏水性及静电作用等引起固定化酶内部底物、其他各种效应物（H+,OH-离子，溶剂）以及产物在微环境和宏观体系之间的不等分配，从而影响酶反应速度的现象。3）分配效应动力学简化：①假定酶被均匀地固定在载体表面，且整个反应系统充分搅拌，混合均匀，排除扩散效应。荷电载体与荷电溶质静电作用产生的分配效应常用分配系数表示分配系数ρ=[Si]/[S]Si：代表底物和其他各种效应物在微环境中的局部浓度S：代表底物和其他各种效应物在宏观体系中的总体浓度根据Boltzmann分配定律，荷电溶质在荷电载体微环境与外部溶液的分配服从分配系数可表示为：[Si]=ρ[S]ρ=exp[-ZeΦ/(KBT)]其中，Ze荷电溶质的电荷，Φ荷电载体产生的静电位，KB为Boltzmann常数，T绝对温度对固定化酶催化反应，分配效应仅影响底物浓度分布，酶的动力学方程仍可用米氏方程表示。V=Vm[Si]/(Km+[Si])=Vm[S]ρ/(Km+[S]ρ)=Vm[S]/(Kappm+[S])其中Kappm=Km/ρ上式表明，分配效应造成的影响是改变Km。ρ=[Si]/[S]Kappm=Km/ρ（1）当载体与底物电荷相同时，[Si]＜[S]，ρ＜1，Kappm＞Km（2）当载体与底物电荷相反时，[Si]＞[S]，ρ＞1，Kappm＜Km（3）上述效应，通过提高反应系统的离子强度，可减弱或消除（4）采用疏水性载体，如果底物为极性物质或电荷性物质，则[Si]＜[S]，ρ＜1，Kappm＞Km如果底物为疏水性物质，则[Si]＞[S]，ρ＞1，Kappm＜Kmρ=exp[-ZeΦ/(KBT)]其中，Ze荷电溶质的电荷，Φ荷电载体产生的静电位，KB为Boltzmann常数，T绝对温度分配效应对H+和OH-的影响：H+和OH-在载体内外也呈不等分布。[Hi+]=[H+]exp[-eΦ/(KBT)]-log[Hi+]=-log{[H+]exp[-eΦ/(KBT)]}pHi=pH+0.43eΦ/(KBT)ΔpH=pHi-pH=0.43eΦ/(KBT)lnexpx=xlogexpx=-0.429xpHi微环境pH宏观环境阴离子载体：ΔpH0ΔpH=pHi-pH=0.43eΦ/(KBT)阳离子载体：ΔpH0ΔpH=pHi-pH=0.43eΦ/(KBT)3．扩散效应底物／产物和其他效应物在固定化酶载体内外之间的迁移扩散速度受到某种限制，造成了不等分布，从而影响反应速度。扩散效应与这些物质的分子量大小，载体的结构及酶反应性质有关。外扩散：底物／产物和其他效应物在宏观体系与酶颗粒表面间的扩散。内扩散：在多孔性固定化载体内，底物、产物和其他效应物在载体颗粒表面与载体内的酶活性部位间的扩散。外扩散效应动力学假定1、惰性载体，不考虑分配效应的影响2、酶固定于液体不能渗透的固体膜表面上，排除内扩散效应的干扰反应过程：底物从溶液中移向膜表面，底物被酶催化为产物，产物从膜表面移向溶液中。酶促反应速度=Vm[Si]/(Km+[Si])底物转移速度=Js([S]-[Si])Js:底物转移系数(1)当外扩散传质速率很快，固定化酶外表面反应速率相对较慢，并成为该反应过程速率的控制步骤时，则Si=S,此时反应速率:V=Vm[Si]/(Km+[Si])=Vm[S]/（Km+[S]）(2)当外扩散传质速率很慢，固定化酶外表面反应速率相对较快，此时外扩散速率成为反应的控制步骤，则Si=0，此时反应速率为:V=Js([S]-[Si])=Js[S]当反应系统处于恒态时，酶促反应速度和底物传递速度相等。V=Vm[Si]/(Km+[Si])=Js([S]-[Si])当Km》[Si]时，则：Js([S]-[Si])=Vm[Si]/Km[Si]=Js[S]/（Vm/Km+Js）V=Vm[Si]/Km=[S]/（1/Js+Km/Vm）当Js》Vm/Km时，则：1/JsKm/VmV=[S]/（1/Vm/Km）=Vm[S]/Km（酶促反应限速）当Js《Vm/Km时，则：1/JsKm/VmV=Js[S]（外扩散限速）Thiele准数（西勒准数μ）μ=Vm[S]/Km（酶促反应限速）Js[S]（外扩散限速）=Vm/KmJs西勒准数μ反映了外扩散效应对反应动力学的影响，代表外扩散效应的大小。μ越小，扩散效应越小；μ越小，扩散效应越大；固定化酶受外扩散因素的影响，当西勒准数μ值为下列何种情况时，是酶促反应限速，发酵效果较好。A、μ=0.1B、μ=2C、μ=10D、μ=1004．微扰效应：由于载体的亲水，疏水作用和介电常数等性质，直接影响酶的催化能力或酶对效应物作出反应的能力。第五节固定化酶及细胞的应用一酶在医学领域的应用尿激酶激活溶纤维蛋白酶原活性溶纤维蛋白酶溶解纤维蛋白凝块利用正常细胞含Ｌ－天冬酰胺合成酶而癌细胞缺乏Ｌ－天冬酰胺合成酶Ｌ－天冬酰胺Ｌ－天冬氨酸＋ＮＨ３Ｌ－天冬酰胺酶Ｌ－天冬酰胺合成酶二药用酶的范围１、由于体内有害物质的积累所引起的疾病。２、由于酶功能不正常、或者酶缺乏、酶量不足所引起的疾病。苯丙氨酸+σ-酮戊二酸苯丙酮酸苯丙氨酸羟化酶降解３、破坏癌细胞的生化环境。三药用酶应用中存在的问题１、外原酶具抗原性，注入人体后易产生过敏反应２、外原酶进入人体后极易被蛋白酶降解，被抑制剂抑制，在体内的半衰期短。３、如何集中到发病部位。四药用酶的剂型及给药方式１、载酶人造细胞：用人工制造的包含药用酶的细胞。载体红细胞：能将大部分酶集中于肝脏，延长半衰期，不引起人体