益生菌基因工程改造和粘膜作为粘膜免疫的递送系统

益生菌的工程化改造和作为粘膜免疫的抗原递送系统简介人兽共患寄生虫病的防治技术研究华支睾吸虫、包虫、血吸虫、囊虫疫苗动物宿主在寄生虫病的传播中起了非常重要的作用，以期通过对动物宿主的免疫阻断疾病传播目前，成功的寄生虫疫苗极少，希望另辟蹊径主要内容益生菌的功能益生菌在疫苗研究中的应用枯草芽孢作为消化道粘膜疫苗递送系统及其工程化改造应用前景存在的问题益生菌功能肠道微生态调节功能（通过消耗氧、产生乳酸等有机酸、种群密度感应、细菌素等调节肠道正常菌群和致病菌群的生理平衡）消化道营养功能（包括合成人体必需的氨基酸、维生素、促进食物消化和吸收的各种酶类)免疫调节功能(通过益生菌的组分促进宿主免疫的形成和调节机体免疫应答，增强宿主的免疫抵抗力）益生菌在疫苗研究中的应用益生菌应用于疫苗研究，是基于其独特的生理特性和免疫调节功能乳酸菌能通过胃酸环境并在肠道厌氧环境下定植在肠粘膜表面芽孢杆菌的芽孢能能够抵抗胃酸和小肠消化酶的作用，能促进肠粘膜吞噬细胞的功能和宿主的免疫应答皮肤、消化道、呼吸道、泌尿生殖道是病原体入侵的主要门户，粘膜免疫对抵抗各种病原的入侵发挥了极为重要的作用目前的疫苗（减毒活疫苗、灭活疫苗、重组蛋白疫苗、DNA疫苗、重组病毒疫苗等）主要采用注射免疫方式，不能有效刺激粘膜免疫。极少有口服疫苗，主要是疫苗在经过消化道时易被酸性环境和各种酶破坏，不能产生有效的保护性免疫新型口服疫苗以乳酸杆菌作为表达系统，将外源抗原进行分泌表达，刺激肠道粘膜免疫以枯草芽孢杆菌作为表达系统，将外源抗原进行分泌型表达或表达在芽孢表面，以分泌的可溶性抗原或重组芽孢颗粒抗原形式刺激粘膜免疫将疫苗的特异性保护与益生菌功能融为一体枯草杆菌作为口服疫苗载体的优势生物安全性高枯草杆菌在营养缺乏的情况下，能产生内生芽孢-抗性好枯草芽孢有独特的免疫学特性：口服枯草芽孢肠道相关淋巴组织（GALT）识别活化GALT分泌型（SIgA）诱导T、B淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子通过淋巴细胞再循环而活化全身免疫系统枯草杆菌作为口服疫苗载体的优势枯草杆菌易于进行遗传工程操作枯草杆菌芽孢生产成本低：枯草杆菌生长快速，对营养要求低，适于现代工业发酵生产重组芽孢疫苗，稳定性高，方便储存、运输，并可以作为食品添加剂使用。通过胃肠道后，大部分枯草杆菌芽孢仍能存活。正进行的下一步工作cercariaemetacercariaemeracidia克隆策略pUS186质粒枯草杆菌基因组提取PCR扩增枯草芽孢外壳蛋白CotC启动子及结构基因pGEX-Ag质粒pUS186-CotC质粒pUS186-CotC-Ag质粒转化枯草杆菌WB600诱导芽孢形成重组芽孢CotC-TP重组芽孢的超微结构示意图芽孢耐性评估细菌：B.subtilisWB600繁殖体,E.coliJM109，B.subtilisWB600芽孢主要试剂模拟胃液：取10mlLB,用盐酸调PH值至2.0,加入胃蛋白酶10mg。模拟肠液：取10mlLB，加胆酸钠（sodiumcholate）20mg，胰液素（pancreatin）10mg,调PH值至7.4。1枯草杆菌芽孢抗性评估枯草杆菌芽孢在模拟胃环境中10,000,000100,000,0001,000,000,0001234枯草杆菌繁殖体在模拟胃环境中1101001,00010,000100,0001,000,00010,000,000100,000,0001,000,000,0001234大肠杆菌在模拟胃环境中1101001,00010,000100,0001,000,00010,000,000100,000,0001,000,000,00012340min15min30min1h0min15min30min1h0min15min30min1h0.000﹪0.0024﹪93.3﹪图3-1在模拟胃环境中枯草杆菌芽孢的存活率图3-2在模拟胃环境中枯草杆菌繁殖体的存活率图3-3在模拟胃环境中大肠杆菌的存活率1枯草杆菌芽孢抗性评估枯草杆菌芽孢在模拟肠环境中100,000,0001,000,000,00010,000,000,0001234枯草杆菌繁殖体在模拟肠环境中1101001,00010,000100,0001,000,00010,000,000100,000,0001,000,000,0001234大肠杆菌在模拟肠环境中1101001,00010,000100,0001,000,00010,000,000100,000,0001,000,000,00010,000,000,00012340h1h2h3h0h1h2h3h0h1h2h3h258.0﹪图3-6在模拟肠环境中大肠杆菌的存活率图3-5在模拟肠环境中枯草杆菌繁殖体的存活率0.0013﹪图3-4在模拟肠环境中枯草杆菌芽孢的存活率92.0﹪ABCD图免疫荧光检测华支睾吸虫表膜蛋白在芽孢表面的表达A:TP31.8；B:TP20.8；C:TP22.3；D:pUS186-Cotc.举例华支睾吸虫表膜蛋白重组芽孢芽孢疫苗免疫大鼠腹腔注射免疫SD大白鼠分5组：naïve、pUS186-Cotc芽孢，及pUS186-Cotc-TP31.8、pUS186-Cotc-TP20.8、pUS186-Cotc-TP22.3表膜蛋白表达株芽孢组用量：腹腔注射1×1010口服免疫6组：其中5组与腹腔注射分组相同，第六组为三表膜蛋白表达株混合芽孢组（cocktail组）。乙醚轻度麻醉大鼠后，分别用1×1010芽孢在第0、1、2、16、17、18、33、34、35天用灌胃针经口免疫各组大鼠，cocktail组为同时给予三表膜蛋白表达芽孢各1×1010。2.1腹腔注射免疫00.20.40.60.811.21.41.61.820week2rdweek4thweeknaïvenon-recombinantsporeTP31.8expressingsporeTP31.8表达株芽孢腹腔注射血清TP31.8特异性IgG水平(OD450)00.20.40.60.811.20week2rdweek4thweekTP31.8IgG1TP31.8IgG2aTP31.8表达株芽孢腹腔注射血清TP31.8特异性IgG1、IgG2a水平00.20.40.60.811.21.41.61.80week2rdweek4thweeknaïvenon-recombinantsporeTP20.8expressingsporeTP20.8表达株芽孢腹腔注射血清TP20.8特异性IgG水平(OD450)00.20.40.60.811.21.40week2rdweek4thweekTP20.8IgG1TP20.8IgG2aTP20.8表达株芽孢腹腔注射血清TP20.8特异性IgG1、IgG2a水平00.20.40.60.811.21.41.61.80week2rdweek4thweeknaïvenon-recombinantsporeTP22.3expressingsporeTP22.3表达株芽孢腹腔注射血清TP22.3特异性IgG水平(OD450)00.20.40.60.811.21.40week2rdweek4thweekTP22.3IgG1TP22.3IgG2aTP22.3表达株芽孢腹腔注射血清TP22.3特异性IgG1、IgG2a水平00.020.040.060.080.10.120.140.16100.10.20.30.40.50.60.71口服TP31.8表达芽孢大鼠血清特异性IgG及粪便IgA水平(OD450)naiveCotCCotC-TP31.8Day15day32day50Day15day32day50AB2.2口服免疫00.020.040.060.080.10.120.140.16100.10.20.30.40.50.60.70.81口服TP20.8表达芽孢大鼠血清特异性IgG及粪便IgA水平(OD450)Day15day32day50Day15day32day50CotC-TP20.8CotCnaiveAB00.020.040.060.080.10.120.140.160.18100.10.20.30.40.50.60.71口服TP22.3表达芽孢大鼠血清特异性IgG及粪便IgA水平(OD450)ABDay15day32day50Day15day32day50CotC-TP22.3CotCnaive00.10.20.30.40.50.6naïveCotCTP31.8TP20.8TP22.3口服免疫第50天粪便中表膜蛋白特异性IgA水平肠道黏膜免疫为肠道寄生虫排虫主要机制。肠道免疫同时也能引起胆道黏膜免疫系统功能增强，使胆道特异性分泌型IgA升高。胆道分泌型IgA能阻碍病原生物对胆管及肠道黏膜的吸附及其所分泌的毒性物质对黏膜的损害，从而增强对胆道及肠道的保护作用。3芽孢疫苗口服免疫后的保护性表达的稳定性质粒不能连续扩增和维持，涂板连续培养10天后，只有5%的菌株含有重组质粒。草鱼和麦穗鱼口服芽孢疫苗及其免疫效果将3种TP重组芽孢杆菌的4L培养基离心获得的芽孢沉淀与0.5kg玉米粉和100g鸡蛋清混匀初步制备鱼用口服饲料选择20尾麦穗鱼分为实验组和对照组，每组各10尾。同时选择20尾草鱼鱼苗，分为实验组和对照组，每组各10尾。将各组鱼苗在实验室生态池内常规饲养，每天作换水及消毒处理。每天早晚投喂研究制备的鱼用口服饲料，每次投喂1g/10尾连续投喂4周后，将筛选阳性的纹沼螺放入小方皿中释放尾蚴，收集200条尾蚴放入小碗中，放入鱼进行攻击感染。每组感染攻击感染后4周后分组检测比较鱼用口服饲料预防麦穗鱼和草鱼感染华支睾吸虫尾蚴的效果单纯芽孢喂食组囊蚴的回收率，囊蚴回收率草鱼为80%，麦穗鱼为145%。3种重组芽孢混合喂食组，均未发现囊蚴?重组枯草芽孢疫苗的应用前景适合做禽畜、水产的益生菌微生态制剂适合各种病原（尤其是经消化道和呼吸道感染）的感染性疾病的疫苗载体实现益生菌和疫苗功能的复合型动物饲料添加剂和食品添加剂。风险评价在连续喂食重组B.substilis芽孢菌30天的大鼠肠腔分离的其他菌株中未发现有重组质粒的水平转移质粒携带的卡那抗性基因水平转移的可能性很小重组质粒在活菌内难以持续扩增和传代，会逐步消失，对环境影响小。存在的问题和解决策略重组枯草芽孢不能在肠道定植，芽孢一次性排出率在99.5%以上，要实现足够的免疫，服用剂量要大，次数多要解决枯草芽孢杆菌繁殖体在肠粘膜的定植能力（改变菌株生理）重组芽孢申报的功能定位和法规限制（遗传修饰的菌株不能申报为益生菌，采用重组蛋白吸附在芽孢表面的物理载体策略）我国关于益生菌的法律法规刻舟求剑，是否应该调整，以促进益生菌行业的发展？希望与各位同仁合作促进益生菌技术的应用与发展！谢谢各位！