药理学实验总结

流式细胞术背景：细胞凋亡是细胞的基本特征之一，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定和一些疾病发生过程等方面起着十分重要的作用。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸又脂膜内侧翻向外侧。在体内，巨噬细胞可以识别翻转到细胞膜表面的PS从而将这些程序性死亡的细胞清除，因此凋亡过程中并不伴随局部的炎症反应，而在细胞坏死的过程中则常常伴随着炎症反应。AnnexinV是一种分子量为35-36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与细胞凋亡过程中翻转到膜外的PS高亲和力特异性结合。PS外翻发生在细胞核破裂，DNA片段化以及凋亡相关蛋白出现之前，这使得AnnexinV与PS的结合成为凋亡早期的一种重要检测标志事件。检测原理：用标记了FITC的AnnexinV作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。细胞坏死的过程中也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞会结合AnnexinV-FITC。正常细胞核早期凋亡的细胞膜是完整的，Propidiumiodide(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。将AnnexinV与PI匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同时与AnnexinV-FITC和PI结合显色，而PI则被排除在活细胞（FITC阴性）和早期凋亡细胞（FITC阳性）之外。在没有巨噬细胞的情况下，凋亡的最后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体，从而使凋亡晚期的细胞也同时被FITC和PI结合染色呈现双阳性。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为（FITC-/PI-）；右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为（FITC+/PI+）；而右下象限为凋亡细胞，显现（FITC+/PI-）。样品染色：1、离心收集悬浮细胞，弃培养基。贴壁细胞用不含EDTA的胰酶消化后离心（300g*8min），收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。2、用冷PBS洗涤细胞两次，尽可能吸尽PBS。3、用400ul(200ul)1xAnnexinV结合液悬浮细胞，浓度大约1x10*6cells/ml。4、在细胞悬浮液中加入5ulAnnexinV-FITC染色液，轻轻混匀后于2-8度避光条件下孵育15分钟。5、加入10ulPI染色液后轻轻混匀于2-8度避光条件下孵育5分钟。6、立即用流式细胞仪或荧光显微镜检测。注意事项：1、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。2、细胞处理要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。3、AnnexinV-FITC和Propidiumiodide(PI)是光敏物质，在操作时请注意避光，尽量减少它们暴露在光下的时间。有必要时可以使用带盖子的冰盒或铝箔纸避光。4、由于细胞凋亡是一个快速和动态的过程，因此最好在染色后立即进行分析。5、使用AnnexinV-FITC试剂盒检测凋亡需要针对活细胞。不需要固定细胞，固定操作会对结果产生干扰。6、如果细胞样品中含有血小板，如血液样品，请使用含有EDTA的缓冲剂并200g离心洗去血小板。因为血小板含有PS，能与AnnexinV结合。7、流式细胞仪检测时，细胞数量应不低于1x10*5。8、如果细胞收集过程中使用了胰酶，需注意用PBS洗净去除残留的胰酶。残留的胰酶会消化并降解AnnexinV-FITC，最终导致染色失败。9、对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色；处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞，胰酶的消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与AnnexinV-FITC的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇使胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中应不用EDTA，EDTA影响AnnexinV与PS的结合。10、成功的检测凋亡受以下几种因素的影响，如细胞类型、细胞膜上PS的密度、发生凋亡时PS翻转的比例、诱导细胞凋亡的方法、所用试剂、诱导凋亡的时间以及实验过程中机械损伤的程度等，把这些影响因素进行优化对试验成功与否至关重要。务必根据每次实验样本类型和操作流程对这些步骤进行优化。11、有极少数细胞株其细胞膜上PS的密度极低，难以染色，此时不适合用AnnexinV方法检测凋亡。细胞、组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型）样品预处理：动物组织：1、切取5-20mg的动物组织材料，在液氮中将组织研磨成粉末，并转移至1.5ml的离心管中。2、然后加400ulACLSolution入和10ul的ProteinaseK。如有凝结块，可以用枪头吹吸打碎。3、震荡混匀1分钟，然后置于55C放置20分钟—3小时，在此期间间或取出混匀，有助于充分裂解。裂解完全的样品应澄清透明。不同来源的组织，完全裂解时间可能差异较大。4、取出样品，待降至室温时轻轻震荡混匀。啮齿类动物（如鼠等）尾巴：1、从动物尾部末端切取0.5—1cm的组织材料，在液氮中将组织研磨成粉末，并转移至1.5ml的离心管中。2、然后加入400ulACLSolution和10ul的ProteinaseK。3、震荡混匀1分钟，然后置于55C水浴10—20分钟，在此期间可以适当取出混匀，有助于充分裂解。4、取出样品，待降至室温时轻轻震荡混匀。培养成熟的动物细胞：1、在500~1000rpm下离心约3~5分钟，收集细胞。2、加入400ulACLSolution和10ul的ProteinaseK。3、震荡混匀1分钟，然后置于55C水浴10—20分钟，在此期间可以适当取出混匀，有助于充分裂解。4、取出样品，待降至室温时轻轻震荡混匀。DNA提取：经过上面预处理的样品按照下面步骤提取基因组DNA。5、在经过预处理好的样品中，依次加入300ulExtsolution和300ulABsolution,用力摇匀，然后12000rpm离心5分钟。溶液将分层，上层为蓝色的抽屉层，下层为透明水相，两层溶液中间可能会有部分沉淀层，DNA在下层水相中。注：如样品量较少或溶液澄清不粘稠，可不添加Extsolution，只添加300ulABsolution,摇匀后离心。6、将枪头穿过上层溶液，深入到下层溶液，将下层溶液仔细吸出到GenCleanColumn中，尽量避免吸到上层溶液及中间层的沉淀。7、8000rpm离心1分钟，取下GenCleanColumn，倒掉收集管中废液。8、将GenCleanColumn放回收集管中，加入500ulWashSolution,8000rpm,室温离心1分钟。9、重复步骤8一次。10、取下GenClean柱，弃去收集管中的废液。将柱放回收集管中，12000rpm，室温离心1分钟，以除去残留WashSolution。11、将柱放入新的洁净1.5ml的离心管中，在柱中央加入50~100ulElutionnBuffer,室温或55C放置2分钟。然后12000rpm,室温离心1分钟。离心管中的液体即为基因组DNA。根据用途，样品可于4C或-20C保存。乳酸脱氢酶（LDH）测定试剂盒一、试剂盒组成及配制：试剂一：基质缓冲液试剂二：辅酶1，配制：每支粉剂加1.3ml双蒸水溶解，溶解后冷冻可保存2周，如需多次使用建议分装冷冻。试剂三：2,4-二硝基苯肼试剂四：4mol/lNaOH，0.4mol配制：10倍稀释。试剂五：2umol/l丙酮酸标准液。二、测定步骤：空白孔标准孔测定孔对照孔双蒸水（ul）25550.2umol/ml标准液（ul)20待测样本（ul）2020基质缓冲液（ul)25252525辅酶1（ul)5混匀，37C温浴15分钟2,4-二硝基苯肼（ul)25252525混匀，37C温浴15分钟0.4mol/lNaOH溶液（ul)250250250250混匀，室温放置5分钟，波长450nm，酶标仪测定吸光度。三、计算及举例：血清中LDH活性（U/L）=测定OD值-对照OD值/标准OD值-空白OD值x标准品浓度xNx1000（N为待测样本测定前稀释倍数）乳酸脱氢酶释放率=培养基中酶活性/培养基中酶活性+细胞层酶活性。试验中需要同时检测培养基和细胞裂解后细胞悬液中的乳酸脱氢酶。四、测定原理：LDH乳酸丙酮酸37C水浴丙酮酸+2,4-二硝基苯肼丙酮酸二硝基苯腙（红棕色）碱性根据比尔定律，可测乳酸脱氢酶活性。五、标准曲线制备：1、前处理：将2umol/ml的丙酮酸标准品用双蒸水分别200倍、100倍、50倍、20倍、10倍、5倍、2倍稀释后按照操作表制作标准曲线。2、操作表：空白孔标准孔双蒸水（ul)255不同浓度丙酮酸标准（ul)20基质缓冲液（ul)2525混匀37C温浴15分钟2,4-二硝基苯肼（ul)2525混匀，37C温浴15分钟0.4mol/l氢氧化钠溶液（ul)250250混匀，室温放置5分钟，波长450nm，酶标仪测定吸光度。免疫细胞化学（免疫荧光染色）一、试剂及材料：六孔板、盖玻片、移液枪、枪头、丙酮、PBS、tritonX-100、H2O2、BSA、一抗、二抗、湿盒、甘油。二、方法：将已灭菌的盖玻片置于6孔培养板中，按10*4~10*5/ml的密度将细胞接种于培养板中进行爬片，培养6~12小时，待细胞贴壁后，3~5天进行免疫细胞组织化学染色鉴定。PBS清洗时将玻片置于小培养皿中。步骤如下：1、PBS清洗标本3次，各3min.2、95%酒精（或冰丙酮等其它固定剂）固定15min.3、空气干燥5min。4、PBS清洗标本3次，各3min。5、0.3%tritonX-100（PBS配）孵育1次15min.6、PBS清洗标本3次，各3min.7、3%H2O2(PBS配）孵育15min.8、PBS清洗标本3次，各3min.9、5%BSA(,PBS配）封闭标本3min.10、一抗（1%BSA配，1:100~1:200）4C过夜。阴性对照最好用一抗来源血清，否则用PBS液（湿盒）11、PBS清洗标本3次，各3min.12、二抗孵育（湿盒）1%BSA配，30min，避光；13、PBS清洗标本3次，各3min，DAPI染核5min，PBS清洗标本3次，各3min。14、95%甘油封片防止荧光猝灭。注意：冲洗时只需轻轻震荡培养皿(易脱片）加一抗、二抗后冲洗时第一次需将玻片倾斜。核蛋白提取试剂盒一、产品组成：提取液A、提取液B、蛋白酶抑制剂混合物、磷酸酶抑制剂混合物。注意：1、蛋白酶抑制剂混合物避免反复冻融；2、如果试剂盒不能短时间内用完，蛋白酶抑制剂混合物不可以一次全部加入提取液。3、蛋白提取液、磷酸酶抑制剂2~8C保存；4、蛋白酶抑制剂-20C保存。二、使用方法：使用注意事项：1、旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。2、实验过程中的所有试剂须预冷；所有器具须放-20C冰箱预冷。整个过程需保持样品处于低温。3、蛋白酶抑制剂储存期间溶液如果出现沉淀，不影响使用，溶解后正常使用。4、可以根据自己试验需要加入其它蛋白酶抑制剂单品。5、Western试验内参可以选用LaminA、LaminB、TBP、HistonH3.细胞蛋白的提取：1、提取液制备：每200ul冷的蛋白提取液A和B中分别加入2ul蛋白酶抑制剂混合物和磷酸酶抑制剂，混匀后置冰上备用。2、取5~10x10*6个细胞，在4C，500xg条件下离心2~3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。3、用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。4、每20ul细胞压积中加入200ul冷的提取液A，高速涡旋震荡15秒或吹打混匀，置冰上15分钟，中间每隔5分钟涡旋震荡或吹打混匀。5、再次高速涡旋震荡5秒，然后在4C，12000g条件下离心5分钟。6、快速将上清吸入另一预冷