发酵液还原糖的测定方法

中间体化验操作法发酵液中糖含量的测定：1．原理：利用还原性糖类的自由配合基在碱性溶液中能将高价铜还原成为低价铜，过量的高价铜在酸性溶液中与碘化钾作用生成Cu2I2，同时析出碘，析出的碘以标准硫代硫酸钠（Na2S2O3）溶液滴定，同时做一空白对照，从两者之间求出糖的含量。反应式如下：酸△(C6H10O6)nn(C6H10O6)水解Cu(OH)2＋Na2SO4CuSO4+2NaOHCHOH—COONaO—CH--COONaCu(OH)2＋Cu＋2H2OCHOH—COOKO—CH--COOKO-CHCOOKCHOCu＋CHOHO4O-CHCOOKCHOHO--CHCOOKCOONaHO--CHCOOK2Cu＋NaOH＋H2O(CHOH)4＋Cu2O＋O--CHCOOKCH2OHHO--CHCOONaO—CHCOOKCHOHOOK过量的Cu＋2H2SO4O—CHCOOKCHOHOONa＋CuSO4＋Na＋＋K＋＋SO42-2CuSO4＋4KI＋2Cu↓2K2SO4＋I2（在酸化条件下）I2＋2Na2S2O32NaI＋Na2S4O62．试剂：1）斐林试剂直接配制法：将酒石酸钾钠800g溶于水中，再溶入硫酸铜160g，加入1N的NaOH溶液1318ml（或固体氢氧化钠580g），最后加入KI400g溶后，加入纯化水至总体积为10000ml，摇匀即得。2）斐林试剂贮备液的制备a．硫酸铜贮备液：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O）800g加纯化水溶解（如浊可用玻璃棉过滤），使总体积成10000ml，摇匀即可。b．酒石酸钾钠贮备液：称取酒石酸钾钠400g，加纯化水使总体积为1000ml摇匀即得。c．斐林试剂混合液：取硫酸铜贮备液1000ml，加酒石酸钾钠贮备液1000ml，摇匀加11mol/L氢氧化钠（NaOH）659.5ml或固体NaOH290g，最后加入碘化钾（KI）200g，溶后加入水，使总体积为5000ml。3）8N的硫酸：取36mol/ml的试剂H2SO4（密度为1.84g/ml）222ml，缓缓注入778ml水中，放冷摇匀，即得。4）0.5%淀粉指示剂：a．称取可溶性淀粉5g，溶于约50ml纯化水中。b．量取950ml纯化水于烧杯中，加热煮沸，将1）液倒入搅拌，使其溶解，冷却至室温倒入1000ml试剂瓶中，置冰箱备用。5）20%碘化钾溶液：称取c．p碘化钾（KI）100克，用纯化水溶解至500ml，摇匀即得。6）4N盐酸（HCl）：量取12N的C．P盐酸（比重1.19）334ml，加纯化水至1000ml，摇匀即得。7）2N盐酸（HCl）：量取上述4N盐酸500ml，加纯化水500ml，摇匀即得。8）0.4N碘酸钾（KIO3）基准溶液：精确称取经研细，并在105℃干燥至恒重的KIO3（AR）基准试剂3.5670g，用纯化水溶入250ml容量瓶中，并稀释至刻度，摇匀即得0.4N的碘酸钾溶液，称量时误差不得超0.02‰。WKIO3的当量浓度=250×0.0367（E/1000）3.5670==0.4N250×0.03567214.0235.67=35.67，=0.03567（KIO3的毫克当量）E=610009）1N硫代硫酸钠（Na2S2O3）贮备液：称取碳酸钠（Na2CO3）20g，溶于约6000ml水中，加入五水亚硫酸钠(Na2SO3·5H2O)2000g，溶解完全后，稀释至1000ml，摇匀过滤继续放置一周后标化备用。标化原理：KIO3＋5KI＋6HCl3I2＋6KCl＋3H2OI2＋2Na2S2O32NaI＋Na2S2O6标化操作：精确吸取已配制1mol/L的硫代硫酸钠溶液100ml于1000ml容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，注入已洗净并用待标定溶液冲2～3次的25ml一等滴定管中，另精确吸取5ml0.4N碘酸钾（HIO3）标准溶液于250ml碘瓶中，加5ml20%碘化钾（KI）溶液，加纯化水10ml，再加2mol/L盐酸（HCl）10ml，立即加盖并用纯化水水封在暗处放置3分钟，然后用上述硫代硫酸钠（Na2S2O3）溶液滴定，用淀粉做指示剂至兰色刚刚消失为终点。要求：0.1mol/ml硫代硫酸钠（Na2S2O3）的结果允许误差在0.0002之间。10）0.1mol/ml硫代硫酸钠（Na2S2O3）：经计算后，量取约1mol/ml的硫代硫酸钠贮备液一定量，稀释至0.1mol/L，摇匀即可。标化操作与1mol/L的Na2S2O3相同。3．测定方法：1）溶糖测定法：吸取发酵滤液2.5ml于50ml具塞刻度试管中，加5ml4mol/L盐酸（HCl）在沸水中水解10分钟，取出后冷却，用纯化水稀释至25ml，取5ml稀释于150ml三角瓶中，加入斐林试剂25ml，摇匀后在电炉上加热沸腾3分钟，用冷水冷却后加入8N硫酸（H2SO4）10ml，摇匀立即以0.1mol/L硫代硫酸钠（Na2S2O3）的滴定液滴定，以淀粉做指示剂，滴定至指示剂由兰变白为止，记下消耗的滴定液数。空白：直接取斐林试剂25ml于150ml三角瓶中，在电炉上沸腾3分钟，其他操作同上。计算：（V空白消耗Na2S2O3-V样品消耗Na2S2O3）×NNa2S2O3=V0.1Na2S2O30.1由0.1mol/ml的硫代硫酸钠（Na2S2O3）的体积即可计算出溶糖的百分含量。注：如所用的标准Na2S2O3的摩尔浓度正好是0.1mol/ml，则不需要再计算。以空白所消耗的Na2S2O3体积减去样品Na2S2O3的体积即为0.1000mol/ml硫代硫酸钠（Na2S2O3）的体积，用此数直接查表即可。2）还原糖测定法：取发酵滤液1ml（如含量在0.4%以上取0.5ml）于150ml三角瓶中，加斐林试剂25ml，其它操作同溶糖做法。空白操作同溶糖测定。计算：以新消耗的Na2S2O3体积数查还原糖表。4．标准曲线的制作：精确称取（先60℃烤1小时，80℃烤1小时，105℃再烤2小时）烤过恒重的基准葡萄糖（AR含量在99%以上）0.5g于100ml容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，摇匀，分别吸取0.5ml、1ml、1.5ml、2ml、2.5ml、5ml、10ml，按糖法测之，以糖的百分含量为横坐标，以0.1mol/L硫代硫酸钠（Na2S2O3）滴定数为纵坐标，做一曲线，再将滴定体积数与糖含量关系列表备用。1）操作注意事项：斐林溶液加量要准确，因铜量是计算的依据。2）要保证电炉上加热沸腾3分钟的准确性，加热后必须冷却才能加8mol/L硫酸（H2SO4），以免碘挥发。3）加入8mol/L硫酸（H2SO4）后开始滴定时要振摇，以免I2挥发。淀粉指示剂在滴定将近终点时加入为宜，否则I2和淀粉形成复合物，碘淀粉影响滴定的准确度。4）Na2S2O3的水溶液遇酸和空气中的氧及水中细菌极易起分解反应。Na2S2O3＋H2CO3NaHCO3＋S2↓＋NaHSO3Na2S2O3＋H2SO4Na2SO4+＋SO2＋H2ONa2S2O3＋1/2O2Na2SO4+S↓水中如含铜离子也能促其分解。2Cu2+＋2S2O32-2Cu+＋S4O62-由此在配制时要用煮沸冷却的纯化水，同时加入少量的碳酸钠，放置数日后，使其稳定，使用溶液时间不可太长，否则浓度易变化。5）KIO3标准液应放在冰箱内，新配制的标准液与旧标准液要核对。消耗Na2S2O3体积的差应在±0.02ml以内。6）标定硫代硫酸钠时个人平行两个结果之差应该小于0.03ml，二人核对结果之差小于0.05ml，否则均应重作。