蛋白酶实验

实验（内容）题目：蛋白酶产生菌的筛选及培养的优化院系生命科学技术学院专业生物技术年级2015级生物技术1班专升本蛋白酶产生菌的选育及发酵培养条件的优化一、实验目的1、学习从土壤中分离蛋白酶产生菌。2、握分离纯化的方法，分离获得并纯化蛋白酶产生菌。3、握正交优化的方法和步骤。二、实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。三、实验器材1、材料：土壤样品2、试剂：牛肉膏蛋白胨培养基及平板、奶粉培养基及平板、45mL无姓名蔡晓晓党珍珍郭肖建闫志文班级生物1班专升本生物1班专升本生物1班专升本生物1班专升本学号20155231013201552310102015523100220155231013菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、3、仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。四、实验步骤（一）配制所需培养基1、牛肉膏蛋白胨固体培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，琼脂1.5～2.0g，水100ml，pH7.22、奶粉培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，琼脂2.0g，水100ml，pH7.0～7.2脱脂奶粉3g，3、牛肉膏蛋白胨液体培养基：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，NaCl0.5g，水100ml，pH7.24、发酵培养基：葡萄糖6.0g,硝酸钠4.0g，磷酸二氢钾0.03g,碳酸钠0.1g,磷酸二氢钠0.4g加水100ml（二）分离1、采集土壤样品，用无菌制备1:10土壤悬液。2、取1:10土壤悬液5mL，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。3、取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h.4、对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。（三）筛选1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48小时，测定平板上菌台直径和水解圈的直径。2、选择水解圈直径与菌落直径比值都较大的单菌落，接入产蛋白酶发酵培养基，30～32℃振荡培养48h,将发酵液过滤或离心，取上清液检测蛋白酶活力进行复筛。（四）蛋白酶活性测定采用Folin酚法，1ml原发酵液加2ml质量分数为0.5%的酪蛋白液，在pH值7.0、37℃水浴15min，再用质量分数为10%的三氯乙酸灭活，然后取1ml上述反应液的离心上清液加1mlFolin-酚在5mL0.55mol/L的Na2CO3的碱性条件下37℃水浴15min测650nm下的吸光值，以加灭活酶液的反应系统为空白。取酶液1ml加入用PH6.8磷酸缓冲液配置的1%酪蛋白1ml，70℃恒温水浴15min，取水迅速加入2ml0.5mol/L三氯乙酸（TCA蛋白变性剂）终止反应。离心取上清1ml做7倍稀释，在275nm测定其紫外吸收值，取相同的粗酶液1ml，加入用PH6.8磷酸缓冲液配制的1%酪蛋白1ml，同时加入2ml0.5mol/L三氯乙酸灭活后，在上述完全相同条件下每分钟水解产生1ug酪蛋白的所需的酶量即为1个酶活单位。由酪蛋白标准曲线方程及酶活定义推得：酶活E=(OD-0.0311)/0.0083×N单位IU/mLN:代表酶液的稀释倍数（五）发酵条件的优化出发菌株接种到不同初始条件的发酵培养基中摇床培养后测定蛋白酶活力以确定最佳蛋白酶产量及活力的培养条件。正交实验法设定三个水平因素A.培养时间12h、24h、36h；B.初始pH7、7.5、8；C.装瓶量2ml、4ml、6ml正交表设计因素水平培养时间(A)初始pH(B)装瓶量（C）112h75ml224h7.510ml326h815ml附录：实验分工及安排党珍珍负责制备培养基以及各种所需的培养皿，试管等的灭菌蔡晓晓负责采集土壤样品，制备悬液，进行分离闫志文负责得到的菌株进行筛选郭肖建筛选出的蛋白酶进行活性测定共同进行发酵条件的优化1.结果及分析正交实验结果实验序号因素水平XABC123456789K1K2K3k1k2K3极差主次因素最优水平最优组合根据最优组合再次培养理论上可得到比实验组更好的结果