第一章酶工程

要舍得花时间，要长期投入。扎扎实实学好每一章节，课后及时复习。动手：上课记笔记，做作业及思考题。注意：抄一遍比看10遍心里更踏实。善于总结所学知识，前后联系，真正学会！具体学习方法基因工程：用“剪刀+糨糊”创造新物种的工程。细胞工程：微观水平的嫁接技术。酶工程：让工厂高效、安静、美丽如画的工程。发酵工程：把微生物或细胞造就成无数微型工厂，将神话变为现实的桥梁。目录酶催化作用的特点影响催化作用的因素酶的分类与命名LOGO酶的活力与测定酶的概念与发展历史酶的生产方法酶工程发展概况第一节酶的概念与发展历史什么是酶？酶（enzyme）是一类由活细胞产生的，具有催化活性和高度专一性的特殊蛋白质，是一类生物催化剂。酶是生物催化剂。酶的本质是蛋白质：这是1926年Summer第一次从刀豆中提纯脲酶后一直为生化学家公认的真理。酶学的知识源于发酵，enzyme词根zyme就是具有“发酵”或“酵母”意义的希腊文。核酶（ribozyme）的发现：1982年Cech发现具有自身催化作用的RNA。脱氧核酶（deoxyribozyme）的发现：1995年Cuenoud等相继报道了DNA也有磷酸酯酶和连接酶的活性。酶的发现及研究历史•人们对酶的认识起源于生产与生活实践。•夏禹时代，人们掌握了酿酒技术。•公元前12世纪周朝，人们酿酒，制作饴糖和酱。•春秋战国时期已知用麴(曲)治疗消化不良的疾病。•酶者，酒母也•1897年，德国巴克纳Buchner兄弟用石英砂磨碎酵母细胞，制备了不含酵母细胞的抽提液，并证明此不含细胞的酵母提取液也能使糖发酵，说明发酵与细胞的活动无关。从而说明了发酵是酶作用的化学本质，为此Buchner获得了1911年诺贝尔化学奖。•1896年,日本的高峰让吉首先从米曲霉中制得高峰淀粉酶,用作消化剂,开创了有目的的进行酶生产和应用的先例。•1878年,给酶一个统一的名词，叫Enzyme，这个字来自希腊文，其意思“Inyeast”。•1913年,米彻利斯和曼吞提出中间产物学说,推导出酶促反应的基本方程式——米氏方程。•1930年，证实酶是一种蛋白质；•80年代初发现了具有催化功能的RNA——核酶(ribozyme)，这一发现打破了酶是蛋白质的传统观念，开辟了酶学研究的新领域，•现已鉴定出4000多种酶，数百种酶已得到结晶，而且每年都有新酶被发现。酶的应用历史•1908年,德国的罗姆制得胰酶,用于皮革的软化。•1908年,法国的波伊登(Boidin)制备了细菌淀粉酶,应用于纺织品的退浆。•1911年,美国的华勒斯坦(Wallestein)制得木瓜蛋白酶,用于除去啤酒中的蛋白质浑浊。•此后,酶的生产和应用逐步发展。然而在50年代以前停留在从微生物，动物或植物中提取酶,加以利用阶段.由于当时生产力落后,生产工艺较繁杂,难以进行大规模工业化生产。•1949年,用液体深层培养法进行细菌淀粉酶的发酵生产,揭开了近代酶工业的序幕。•50年代以后,随着生化工程的发展,大多数酶制剂的生产已转向微生物流体深层发酵的方法。酶的应用越来越广泛。•50年代：开始了酶固定化研究。1953年德国科学家首先将聚氨基苯乙烯树脂与淀粉酶,胃蛋白酶,羧肽酶和核糖核酸酶等结合,制成了固定化酶。•60年代，是固定化酶技术迅速发展的时期。1969年,日本的千烟一郎首次在工业上应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸。出现了“酶工程”这个名词来代表有效利用酶的科学技术领域。•1971年第一届国际酶工程学术会议在美国召开,当时的主题即是固定化酶，进一步开展了对微生物细胞固定化的研究。•1973年,千烟一郎首次利用固定化的大肠杆菌细胞生产L-天冬氨酸。•1978年,日本的铃木等固定化细胞生产α-淀粉酶研究成功.所以说,70年代是固定化细胞技术取得进展的时期.•80年代，固定化细胞已能用于生产胞外酶,因此,80年代又发展了固定化原生质体技术,排除了细胞壁这一障碍。•在酶的固定化技术发展的同时,酶分子修饰技术也取得了进展。•60年代，用小分子化合物修饰酶分子侧链基团,使酶性质发生改变;•70年代,修饰剂的选用、修饰方法上又有了新的发展。•此外,对抗体酶,人工酶,模拟酶等方面,以及酶的应用技术研究,在近20年均取得了较大进展,使酶工程不断向广度和深度发展,显示出广阔而诱人的前景。第二节酶催化作用的特点酶催化作用的特点•专一性强•催化效率高•反应条件温和•多样性•活泼可调节性•易变性•有些活性与辅酶或辅因子有关三大主要特点一、酶的专一性一种酶只能催化一种或一类结构类似的底物，进行某种类型的反应。绝对专一性：一种酶只能催化一种物质进行一种反应（立体异构专一性）相对专一性：一种酶能够催化一类结构相似的物质进行某种相同类型的反应（键专一性和基团专一性）选择底物，确定最适条件确定米氏常数测试其它可能底物，确定专一性酶的专一性的确定二、酶的催化效率•酶转换数Kcat：每个酶分子每分钟催化底物转化为产物的分子数。也即是每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数。•酶的催化反应的速度比非酶反应高108-1020倍，比非酶催化剂高107-1013倍。酶可以使反应所需的活化能显著降低三、酶催化作用的条件•酶催化一般在常温、常压、pH近中性的条件下进行。第三节影响酶催化作用的因素•1、底物浓度的影响在底物浓度较低的情况下，[S]与v成正比，当底物浓度达到一定数值时，[S]与v不再成正比，而是趋于平衡•2、酶浓度的影响在底物浓度足够高的条件下，酶催化反应速度与酶浓度成正比V=K[E]酶浓度对酶促反应速度的影响0123450.001.002.003.004.005.00[E]v•3、温度的影响–最适温度：在某一特定温度条件下，酶催化反应速度达到最大，这一温度即为最适温度4、pH的影响5、抑制剂的作用酶的抑制作用（inhibition）：酶的必需基团的性质受到某种化学物质的影响而发生阻断或改变，导致酶活力的降低，这时酶蛋白一般并未变性。酶的失活（inactivation）:酶蛋白变性引起的酶活力的降低或消失。酶的去激活作用（deactivatoin）：因激活剂的除去而引起酶活力的降低，如EDTA去处两价金属离子后使很多受离子激活的酶活力降低，引起去激活的化合物只和激活剂直接作用而不和酶直接结合，抑制剂则和酶直接发生作用。抑制剂种类•细胞正常代谢产物——作为某一种酶的抑制剂，在细胞代谢中起调节作用•外源物质——主要有各种无机离子，小分子有机物和蛋白等。eg：Ag+Hg2+Pb2+等重金属离子均有抑制作用抑制作用的分类•不可逆抑制：抑制剂与酶共价结合后，抑制剂难以除去，酶活不恢复•可逆抑制：抑制剂与酶非共价结合，将抑制剂除去后酶活可恢复可逆性抑制•竞争性（competitive）抑制•反竞争性（uncompetitive）抑制•非竞争性（noncompetitive）抑制竞争性抑制作用定义：抑制剂和底物竞争与酶分子结合而引起的抑制作用•竞争性抑制的机制抑制剂的化学结构与底物相似，能结合酶活性中心的底物结合位点。在相同的抑制剂浓度下，对酶的抑制程度将随[S]的增加而降低。抢凳子反竞争性抑制作用定义：在底物与酶分子结合生成中间复合物后，抑制剂再与中间复合物结合而引起的抑制作用。反竞争性抑制的特点:抑制剂I只能和ES结合，生成不能形成产物的EIS复合物。非竞争性抑制作用定义：抑制剂与底物分别与酶分子上的不同位点结合，而引起酶活性降低的抑制作用6、激活剂的影响•能够增加酶的催化活性或使酶的催化活性显示出来的物质称为激活剂或活化剂。离子：Mg2+,Mn2+,Ca2+,Na+,K+,Fe2+,Zn2+,Cl-酶：胰蛋白酶等为了充分发挥酶的催化功能，在酶的应用过程中，一般应添加适宜的活化剂使酶得以活化。第四节酶的分类与命名迄今为止所发现的4000多种酶中，现已有2500余种酶被鉴定出来，用于生产实践的酶有近200种，其中半数用于临床。1961年以前，人们根据酶作用的底物名称、反应、性质及酶来源，对该酶冠名。（一）习惯命名方法（1）根据作用底物来命名，如淀粉酶、蛋白酶等。（2）根据所催化的反应的类型命名，如脱氢酶、转移酶等。（3）两个原则结合起来命名，如丙酮酸脱羧酶等。（4）根据酶的来源或其它特点来命名，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。这种命名法缺乏科学系统性，易产生“一酶多名”或“一名多酶”问题。如分解淀粉的酶，若按这种命名法则有三种名称，如淀粉酶、淀粉水解酶和细菌淀粉酶。对于淀粉酶来说，强调的是底物；对淀粉水解酶来说，既强调底物又指出酶催化反应的性质；而细菌淀粉酶强调的是酶的来源和作用。问题：该命名法规定，每种酶的名称应明确标明底物及所催化反应的特征，即酶的名称应包含两部分：前面为底物，后面为所催化反应的名称。若前面底物有两个，则两个底物都写上，并在两个底物之间用“：”分开，若底物之一是水，则可略去。(二)国际系统命名法酶的命名有两种方法：系统名、惯用名。系统名：包括所有底物的名称和反应类型。乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+乳酸：NAD+氧化还原酶惯用名：只取一个较重要的底物名称和反应类型。乳酸：NAD+氧化还原酶乳酸脱氢酶对于催化水解反应的酶一般在酶的名称上省去反应类型。1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把蛋白酶分成6大类：Eachenzymeisnowclassifiedandnamedaccordingtothetypeofchemicalreactionitcatalyzes.Soanenzymeisassignedafour-numberclassificationandatwo-partnamecalledasystematicname.InadditionrecommendednameissuggestedbyIUBforeverydayuse.E.C.X.X.X.X乳酸脱氢酶EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，H受体为NAD+该酶在亚亚类中的流水编号•氧化-还原酶催化氧化-还原反应。•主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。•如乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。(1)氧化还原酶OxidoreductaseCH3CHCOOHOHNAD+H+CH3CCOOHONADHAH+B=A+BH•转移酶催化基团转移反应，即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如，谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。(2)转移酶TransferaseCH3CHCOOHNH2HOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2CH3CCOOHOAB+C=A+BC•水解酶催化底物的加水分解反应。•主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。•例如，脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应：(3)水解酶hydrolaseH2OCOOCH2CH3RRCOOHCH3CH2OHAB+H2O=AOH+BH•裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。•主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。•例如，延胡索酸水合酶催化的反应。(4)裂合酶LyaseHOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOHAB=A+B•异构酶催化各种同分异构体的相互转化，即底物分子内基团或原子的重排过程。•例如，6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。(5)异构酶IsomeraseOCH2OHOHOHOHOHOCH2OHCH2OHOHOHOHA=B•合成酶，又称为连接酶，能够催化C-C、C-O、C-N以及C-S键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。A+B+ATP+H-O-H===AB+ADP+Pi•例如，丙酮酸羧化酶催化的反应。丙酮酸+CO2草酰乙酸(6)合成酶LigaseorSynthetase核酸类酶（R酶）的分类•自1982年以来，被发现的核酸类酶越来越多，对它的研究越来越广泛和深入。但是对于分类和命名还没有统一的原则和规定。•根据酶催化反应的