第四章基因工程的基本技术3DNA序列分析

ChapterFour基因工程的基础知识与基本技术第三节DNA序列分析Sanger双脱氧链终止法Maxam-Gilbert化学裂解法12测序的常用方法1.末端终止法2.化学裂解法3.DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出优点简便、迅速、应用广泛不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序1.高负荷，1块胶可测16个样品；2.机读不需放射自显影；3.安全不用同位素；4.简单迅速8-10hSanger双脱氧链终止法(chain-terminatormethod)1977年Sanger充分利用DNA复制的生物学特性,设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法,进行DNA序列测定,即双脱氧链终止法因Sanger法测定了碱基序列,获得1980年诺贝尔化学奖(注：1958年因用酶法测得人胰岛素的氨基酸排序而得诺奖)一、1.Sanger双脱氧链终止法原理基本原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子；利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP3’不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。2具体操作：测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A,C,G,T核苷三磷酸（称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP）,然后进行聚合反应。在第一个反应中,ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H,所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。假如有一个DNA,互补序列是GATCCGAT,我们试着做一下:在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP,所以遇到G,T,C三个碱基时没什么问题,但遇到A时,掺入的可能是dATP或ddATP,比如已合成到G,下一个如果参与反应的是ddATP则终止,产生一个仅有2个核苷酸的序列:GA,否则继续延伸,可以产生序列GATCCG,又到了下一个A了.同样有两种情况,如果是ddATP掺入,则产生的序列是GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生GATCCGAT.将得到如下结果：1产生的都是以A结尾的片段:GA,GATCCGA。234产生的都是以C结尾的片段:GATC,GATCC产生的都是以G结尾的片段:G,GATCCG产生的都是以T结尾的片段:GAT,GATCCGAT制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。3、技术路线：制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列4.双脱氧终止法测序反应体系：DNA聚合酶单链DNA模板带有3’-OH末端的单链寡核苷酸引物Mg2+4种dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)4种ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)Thisfigureshowsthestructureofadideoxynucleotide(noticetheHatomattachedtothe3'carbon).AlsodepictedinthisfigurearetheingredientsforaSangerreaction.Noticethedifferentlengthsoflabeledstrandsproducedinthisreaction.5.测序过程:(1)模板纯化与引物合成(2)DNA链的延长和合成阻断四个试管分别加入DNA聚合酶dNTP标记引物终止剂不同ddAddGddCddT四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链(3)电泳ACGT次序高压电泳(4)放射自显影得到直读图象与PCR的不同之处？思考Maxam-Gilbert化学裂解法化学裂解法是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来测定DNA序列,也简称作化学法。某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而使N-糖苷键断裂，致使在3’和5’位上的磷酸二酯键断裂，戊糖脱落。硫酸二甲酯可作用于嘌呤环，而联氨可作用于嘧啶环二、1.化学裂解法测序的原理(1)用放射性核素标记待测DNA一侧末端(2)将标记DNA分为G、A+G、C+T、C4个反应体系(3)用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组混合物(4)电泳分离，放射自显影得到图谱，即可读出DNA序列在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：G反应----硫酸二甲酯（DMS）使G的N7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶（也叫六氢吡啶）置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。G+A反应----甲酸使嘌呤环上N原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。T+C反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。C反应----在高NaCl存在时，只有C与肼（联氨）发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换碱基特异性修饰及裂解反应体系修饰试剂碱基修饰反应置换试剂断裂点G硫酸二甲酯鸟嘌呤甲基化六氢吡啶GG+A甲酸脱嘌呤作用六氢吡啶G和AC+T肼嘧啶开环六氢吡啶C和TC肼（加盐）胞嘧啶开环六氢吡啶C（1）限制酶消化待测DNA，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化回收每1个片段作为测序材料（2）碱性磷酸酶处理消除5’磷酸（3）多核苷酸酶催32PdNTP标记（5’-OH）末端（4）使标记片段变性为单链（5）分4个反应体系，按上述程序（4个机制）化学处理，严格控制反应条件。（使得平均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G反应，则在DNA链上任意位置G断裂），这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的DNA片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长（6）电泳（7）放射自显影（8）4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出2.化学法测序的基本步骤3.化学法的优点化学法一个明显的优点，即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此利用化学法可以对合成的寡核苷酸进行测序，可以分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，不能通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用.不需酶催化不用合成引物试剂价格低5′和3′端均可标记，可从两方向测同一DNA操作繁琐、费时、分辨率较低三全自动激光荧光DNA测序DNA自动测序仪的应用实现了凝胶电泳、初始数据获取、碱基阅读等步骤自动化。自动测序仪的设计原理是采用荧光标记DNA片段，并用激光激活的荧光探测系统，检测序列反应的分离产物，读出电泳条带所示的碱基顺序。分离产物有两种基本方法：单荧光标记四泳道分离和四荧光标记的单泳道分离。四标记单泳道法：ABI公司（美国应用生物系统公司）发展的四标记单泳道法是用4种不同的荧光标记物标记4个反应的产物，4个反应在一个泳道中电泳分离。每个反应产物用不同颜色的荧光标记进行区分，再用计算机将经过荧光探头的不同颜色顺序转变成测序信息。这种同一泳道的分离避免了泳道间差异对测序的影响。四荧光标记的单泳道分离的测序原理荧光标记物ddGTPddATPddTTPddCTP聚合反应及产物OH3ˊP5ˊ5ˊPHODNA聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP5ˊPddATPddGTP5ˊPddTTP5ˊPddCTP5ˊP荧光化合物标记链终止法以荧光颜色为标记信号，每种ddNTP各有1种代表颜色；整个反应在一个试管中进行；当新合成的终止单链通过荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷酸并由电脑记录。注意：上机前变性，骤冷使DNA变为单链分析仪器的新发展：377型遗传分析仪377型DNA全自动测序仪采用经典的聚丙烯酰胺凝胶的电泳方式,结合美国应用生物系统公司专利的四色荧光标记,激光检测,一个泳道检测的方法,具有测序结果准确性好,精度高,操作简便快速等特点,已成为全球应用最多最广泛的全自动DNA测序仪之一作业：3DNA测序有哪些方法4Sanger双脱氧链终止法原理1PCR技术的基本原理。2PCR反应的基本成分。