肺炎克雷伯菌的耐药分析实验方案细则

北京地区犬源性肺炎克雷伯菌的耐药分析1.样本采集：采集地点：美联众合所有动物医院、农大动物医院采集样本来源：疑似病例（犬）的呼吸道分泌物、粪便、尿液采集工具：鼻咽拭子100只、尿杯50个、便杯50个（网上购买）接种及接种后培养地点：美联众合爱康动物医院，37℃恒温箱培养24小时，观察结果。培养工具：生理盐水稀释后，接种于麦康凯培养基和血平板培养基（培养基打算跟着医院订一些，再开始采样）2.细菌分离观察菌落形态：直径约1～2mm的黏液状菌落，以铂金环挑取易拉成丝。麦康凯：菌落呈红色。血平板：鲜血琼脂上不溶血。疑似菌落纯培养：营养琼脂培养基？革兰氏染色后镜检：革兰氏阴性菌，较短粗的球杆菌，大小0.5～0.8×1～2um，单独、成双或短链状排列。无芽胞，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数有菌毛。生化试验：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、枸橼酸盐、M.R、V-P、硫化氢、吲哚、尿素、硝酸盐、明胶、鸟氨酸脱羧酶生化试验试剂及实验用品？预期试验结果：葡萄糖+M.R．+乳糖+V-P+麦芽糖+硫化氢-甘露醇+吲哚+蔗糖+尿素分解+枸橼酸盐利用-硝酸盐还原-鸟氨酸脱羧酶+明胶液化+16SrRNAV3可变区基因扩增及测序：煮沸法提取DNA做模板。rRNAV3可变区通用引物(P1：5．_CCTACGG—GAGGCAGCAG一3；P2：5一CCGCGGCTGCTGG一3)扩增V3可变区片段，预期片段大小为16Obp扩增条件为：94℃预变性3min，94℃变性30S，55℃退火30s，72℃延伸1rain，循环30次后72℃延伸5min扩增产物经过回收纯化后送公司双向测序。3.细菌的保存与复苏30%甘油保存细菌，-80℃备用；37℃复苏，划线接种于LB营养琼脂4.药敏试验：K-B法检测药物敏感程度：药敏纸片？抗菌药物为:氨苄西林、哌拉西林、头孢唑林、头孢呋辛、头孢噻肟、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、氨曲南、亚胺培南、美罗培南、氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林/他唑巴坦、阿莫西林/克拉维酸、头孢哌酮/舒巴坦、阿米卡星、庆大霉素、环丙沙星、磺胺甲噁唑/甲氧苄啶、四环素、氯霉素将菌液均匀涂布普通琼脂平板，贴上药敏纸片，置37℃恒温箱培养24h。MIC：采用琼脂双倍稀释法。以多头接种器将待检菌悬液分别点种于含不同浓度药物的琼脂平板表面,每点接种菌量为10CFU,37℃培养18h，观察结果,无细菌生长的抗菌药物最低浓度为MIC。