脂肪酶淀粉酶测定方法

脂肪酶测定——采用p-NPP法取0.5g样品，加去离子水10mL，40℃水浴浸泡2h，过滤。取滤液1mL于试管中，加入pH8.0缓冲液3mL和1mmol/Lp-NPP溶液0.1mL于40℃下精确反应3min，迅速置于冰上终止反应。在波长405nm处测定吸光度值。对照管酶液用等体积去离子水代替，其余试剂相同。Npp标准曲线Y=0.287x+0.0861（y：吸光度x：NPP浓度（umol/L））试剂配制：1mmol/Lp-NPP溶液：称取0.0378gpNPP，加入1mL曲拉通-100与5mL异丙醇，用Tris-HCL（pH8.0）定容至100mL。pH8.0Tris-HCl：50mL0.1Mtris碱溶液与29.2mL0.1MHCl溶液混合，加蒸馏水定容至100mL。淀粉酶测定称取六神曲0.5g，研细，用20mL去离子水40℃浸泡1h，过滤。取2只250mL的碘瓶，各加入5%的淀粉液25mL，10mL醋酸钠缓冲液（pH4.5），10mL蒸馏水，摇匀，40℃水浴预热5min。A管中加入滤液5mL，准确反应1h，立即加2mol/LHCl1mL终止反应，B管中先加入HCl，再加滤液5mL。2只碘瓶分别加入0.05mol/L碘液10mL，0.1mol/L氢氧化钠45mL，边滴边振摇，暗处放置20min，加入1mol/L硫酸2mL，用0.1mol/L硫代硫酸钠滴定至无色。每份样品测定3次。记录消耗硫代硫酸钠的体积，计算得淀粉酶活力。淀粉酶活力是指1g六神曲粉末在一定条件下(T=40℃，pH=5.0)，1h内催化可溶性淀粉水解生成葡萄糖的毫克数。计算公式:淀粉酶活力=［c×(vB－vA)·M·N］/2×m·t式中:c为硫代硫酸钠的浓度(mol/L)，M为葡萄糖的摩尔质量(g/mol)，N为酶液稀释倍数，VA为样品滴定值(mL)，VB为空白滴定液(mL)，m为六神曲的取样量(g)，t为反应时间(h)，淀粉酶活力单位为mg/(g·h)。试剂配制pH4.5醋酸钠缓冲液：18g醋酸钠加9.8mL冰醋酸，定容至1000mL。1mol/L硫酸溶液：量取6mL浓硫酸，倒入适量水中，用水稀释至100mL。0.1mol/L碘液：取碘13.0g，加碘化钾36g与水50ml溶解后，加盐酸3滴与水适量使成1000ml，摇匀，用垂熔玻璃滤器滤过。蛋白酶活力测定称取六神曲1g，研细，加蒸馏水20ml，于40℃水浴放置1h，间断搅拌，过滤，滤液以磷酸钠缓冲液稀释1倍。取1mL稀释液置离心管中，于40℃水浴预热5min，加入预热的酪蛋白1mL，保温10min，立即加入0.4mol/L三氯醋酸2ml，终止反应，继续置水浴中保温20min，使残余蛋白质沉淀后离心滤过。取1mL滤液，加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，福林试液1mL，蒸馏水2mL，摇匀，置水浴锅中，40℃保温显色20min。以试剂溶液为空白，于763nm波长处测定吸光度。在40℃时每1min水解酪蛋白产生1g酪氨酸的酶量，定义为1个蛋白酶活力单位。酪氨酸标准曲线：y=8.0061x+0.0006式中Y为吸光度，x为酪氨酸浓度（g/mL）计算公式:蛋白酶活力=(y-0.0006)·N·V/(8.0061×m·t)式中:t反应时间(h)，m酶粉的质量(g)，N酶液稀释倍数，V溶液体积(ml)，8.0061为回归方程的斜率，0.0006为回归方程的截距，蛋白酶活力单位为mg/(g·h)。