第八单元现代生物科技--第1节

1基因工程[考纲要求]1.基因工程的诞生(Ⅰ)。2.基因工程的原理及技术(Ⅱ)。3.基因工程的应用(Ⅱ)。4.蛋白质工程(Ⅰ)。【回顾基础知识】一、基因工程的概念基因工程：又叫做________技术或________技术，是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以________，然后放到另一种生物的细胞里，________地改造生物的遗传性状。二、基因工程的操作工具1．限制性核酸内切酶——“分子手术刀”，又称为________。特点：能够识别DNA特定的______________，切开两个________之间的____________。限制酶切割DNA产生的末端有两种形式：__________和________。2．DNA连接酶——“分子缝合针”作用：将双链________“缝合”起来，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的____________。3．基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”(1)常用载体：____。(2)质粒载体的特点：①能够在细胞内________并稳定保存。②具有一个或多个________________，便于外源DNA片段插入其中。③具有特殊的________，供重组DNA的鉴定和选择。三、基因工程的基本操作程序1．目的基因的获取：(1)从______________中获取；(2)利用____________扩增目的基因；(3)________合成。2．____________的构建(核心)(1)目的：使________基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。3．将目的基因导入受体细胞(转化)(1)将目的基因导入植物细胞：常用方法有__________法、基因枪法和__________法。(2)将目的基因导入动物细胞：常用方法是________法。(3)将目的基因导入微生物细胞：受体细胞――→Ca2＋细胞4．目的基因的________与________。答案：一、基因拼接DNA重组修饰改造定向二、1.限制酶核苷酸序列核苷酸磷酸二酯键黏性末端平末端2．DNA片段磷酸二酯键3.(1)质粒(2)①自我复制②限制酶切割位点③标记基因三、1.(1)基因文库(2)PCR技术(3)人工2．基因表达载体(1)目的(2)标记RNA聚合终止鉴别筛选3．(1)农杆菌转化花粉管通道(2)显微注射(3)感受态4.检测鉴定【核心考点突破】考点一聚焦基因工程的概念及基本工具1．分析基因工程的概念(1)供体：提供目的基因。(2)操作环境：体外。(3)操作水平：分子水平。(4)原理：基因重组。(5)受体：表达目的基因。(6)本质：性状在受体体内表达。(7)优点：克服远缘杂交不亲和的障碍，定向改造生物的遗传性状。2．完成理解基因工程的操作工具比较表：项目限制性核酸内切酶(分子手术刀)DNA连接酶(分子缝合针)运载体(分子运输车)特性或条件识别特定的______序列，并在__________切割DNA分子一般作用于两条具有相同的______的DNA分子能够在宿主细胞中____并稳定____；具有一个或____个限制酶切位点；具有____基因作用提取____基因，切割____构建重组DNA分子将________转移到宿主细胞中并大量复制结果将DNA分子切成DNA片段，产生____末端相同的黏性末端之间形成________键形成重组________答案：核苷酸特定的位点；黏性末端；复制保存多标记；目的运载体；目的基因；黏性；磷酸二酯；DNA易错警示巧辨基因工程操作工具的8个易错点(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便于进行检测。2(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。[练习]1．如图所示为部分双链DNA片段，下列有关基因工程中工具酶功能的叙述错误的是()A．切断a处的酶为限制酶B．连接a处的酶为DNA连接酶C．切断b处的酶为DNA解旋酶D．连接b处的酶为RNA聚合酶答案D解析限制酶能识别特定的核苷酸序列，并且能在特定的切点上切割DNA分子，通常形成黏性末端，即能切割DNA链外侧的磷酸二酯键(图中的a处)，内侧碱基对之间的氢键(b处)可通过DNA解旋酶水解。DNA连接酶将切断的磷酸二酯键进行连接，即图中的a处。RNA聚合酶的作用是催化DNA的转录。2．限制酶MunⅠ和限制酶EcoRⅠ的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如图表示四种质粒和目的基因，其中，箭头所指部位为限制酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是()答案A解析由图可知，质粒B上无标记基因，不适合作为载体；质粒C和D的标记基因上都有限制酶的识别位点；只有质粒A上既有标记基因，且MunⅠ的切割位点不在标记基因上。1．与DNA有关的酶(1)五种相关酶的比较作用底物作用部位形成产物限制酶DNA分子磷酸二酯键黏性末端或平末端DNA连接酶DNA片段磷酸二酯键重组DNA分子DNA聚合酶脱氧核苷酸磷酸二酯键子代DNADNA解旋酶DNA分子碱基对间的氢键形成脱氧核苷酸单链DNA(水解)酶DNA分子磷酸二酯键游离的脱氧核苷酸(2)限制酶和DNA连接酶之间的关系图示2．对载体的分析考点二基因工程的操作步骤观察基因工程的操作过程，分析每一步骤的操作程序1．完成基因工程的基本操作流程图：1．获取目的基因(1)直接分离从基因组文库中获取：即用限制酶进行切割、分离从cDNA文库中获取：即利用mRNA反转录形成利用PCR扩增技术：获取大量目的基因(2)人工化学合成：适用于分子较小的基因。2．基因表达载体的构建——基因工程的核心(1)目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。(2)基因表达载体组成目的基因启动子：为RNA聚合酶识别和结合的部位，驱动转录mRNA终止子：使转录终止的一段有特殊结构的DNA短片段标记基因：为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因mRNAPCR基因组文库cDNA文库构建基因表达载体目的基因(3)构建过程条件目的稳定并能复制目的基因稳定存在且数量可扩大有一个至多个限制酶切割位点可携带多个或多种外源基因具有特殊的标记基因便于重组DNA的鉴定和选择33．将目的基因导入受体细胞生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T­DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上→表达将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受精卵发育→获得具有新性状的动物Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子4．目的基因的检测与鉴定易错警示基因工程操作的8个易错点(1)目的基因的插入位点不是随意的：基因表达需要启动子与终止子的调控，所以目的基因应插入到启动子与终止子之间的部位。(2)基因工程操作过程中只有第三步(将目的基因导入受体细胞)没有碱基互补配对现象，第一步存在逆转录法获得DNA，第二步存在黏性末端连接现象，第四步检测存在分子水平杂交方法。(3)原核生物作为受体细胞的优点：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。(4)一般情况下，用同一种限制酶切割质粒和含有目的基因的片段，但有时可用两种限制酶分别切割质粒和目的基因，这样可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。(5)目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程，称为转化。转化的实质是目的基因整合到受体细胞染色体基因组中。(6)不熟悉标记基因的种类和作用：标记基因的作用——筛选、检测目的基因是否导入受体细胞，常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。(7)对受体细胞模糊不清：受体细胞常用植物受精卵或体细胞(经组织培养)、动物受精卵(一般不用体细胞)、微生物(大肠杆菌、酵母菌)等。要合成糖蛋白、有生物活性的胰岛素则必须用真核生物酵母菌(需内质网、高尔基体的加工、分泌)；一般不用支原体，原因是它营寄生生活；一定不能用哺乳动物成熟的红细胞，原因是它无细胞核，不能合成蛋白质。(8)还应注意的问题有：①基因表达载体中，启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。②基因表达载体的构建是最核心、最关键的一步，在体外进行。[练习]3．下列有关基因工程操作的叙述中，正确的是()A．用同种限制酶切割载体与目的基因可获得相同的黏性末端B．以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因的碱基序列相同C．检测到受体细胞含有目的基因就标志着基因工程操作的成功D．用含抗生素抗性基因的质粒作为载体是因为其抗性基因便于与外源基因连接答案A解析一种氨基酸可以由多种密码子控制，因此以蛋白质的氨基酸序列为依据合成的目的基因与原基因通常不同；只有目的基因表达，使受体表现出目标性状或获得目标产物才标志着基因工程操作的成功；抗生素抗性基因作为标记基因，用于检测目的基因是否导入受体细胞。4．浙江大学农学院喻景权教授课题组研究发现，一种植物激素——油菜素内酯能促进农药在植物体内的降解和代谢。用油菜素内酯处理后，许多参与农药降解的基因(如P450基因和红霉素抗性基因)的表达和酶活性都得到提高，在这些基因“指导”下合成的蛋白酶能把农药逐渐转化为水溶性物质或低毒甚至无毒物质，有的则被直接排出体外。某课题组进一步进行了如下的实验操作，请回答下列问题：(1)获得油菜素内酯合成酶基因的方法有____________________________________________________________。步骤①用PCR技术扩增基因时用到的耐高温酶通常是指____________________________；步骤②用到的酶有4_________________________________。(2)图中导入重组质粒的方法是____________，在导入之前应用一定浓度的__________________处理受体细菌。(3)导入重组质粒2以后，往往还需要进行检测和筛选，可用____________________制成探针，检测是否导入了重组基因，在培养基中加入________________可将含有目的基因的细胞筛选出来。(4)请你为该课题命名：____________________________________________________。答案(1)从cDNA文库中获取、从基因组文库中获取、人工合成目的基因或PCR扩增技术(任选其中两项即可)TaqDNA聚合酶限制酶和DNA连接酶(2)转化法氯化钙溶液(3)红霉素抗性基因红霉素(4)探究油菜素内酯能否促进土壤中农药的分解解析进行基因工程操作时，首先要获取目的基因，其方法有多种：从cDNA文库中获取、从基因组文库中获取、人工合成目的基因或PCR扩增技术等。在构建基因表达载体的过程中，用到的工具酶有限制酶和DNA连接酶。图中的受体细胞是细菌，故用转化法导入基因表达载体，导入后，需检验和筛选。从图中可以看出，最终是通过对照实验来检验转基因细菌对土壤中残留农药的分解能力。考点三关注基因工程的应用和蛋白质工程1．基因工程的应用(判一判)(1)我国的转基因抗虫棉转入的抗虫基因是Bt毒蛋白基因(√)(2)利用乳腺生物反应器能够获得一些重要的医药产品，如人的血清