第八章_PCR技术及其应用

第八章PCR技术及其应用前言PCR技术简史第一节PCR技术原理和工作方式第二节PCR产物的克隆第三节PCR扩增未知DNA片段第四节与反转录相关的PCR第五节PCR产生DNA指纹第六节实时定量PCR前言PCR技术简史链式反应：chainreaction燃烧中的链式反应：有焰燃烧都存在链式反应。可燃物受热时不仅会汽化，而且分子会发生热裂解作用，产生高度活泼的、易与其他自由基和分子反应的自由基，使燃烧持续进行下去。核链式反应：指能自持进行的原子核反应。如铀-235核受到中子轰击后分裂成两块，同时放出二至三个次级中子和一定能量。除去损耗以后，这些次级中子中如能至少剩下一个以引起另一个铀-235核裂变，则裂变反应就可继续下去，这样的链式反应是自持的。原子弹与核反应堆是根据这一原理而设计的。3•DNA的复制•聚合酶链反应的发明PCR：polymerasechainreaction，聚合酶链式反应。1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了……ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5’AUCGCG5’引物酶引物酶ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC5’3’TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG3’5’DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5’AUCGCG5’TAGCGCTATCGCATCGACGCT3’ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3’DNA聚合酶DNA聚合酶1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E.coliDNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪KaryB.MullisTheUnusualOriginofthePolymeraseChainReaction1989年美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,比喻1989年为PCR爆炸年,Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段72℃94℃55℃PCR循环一、PCR的基本原理类似于DNA的体内复制。首先待扩增DNA模板加热变性解链，随之将反应混合物冷却至某一温度，这一温度可使引物与它的靶序列发生退火，再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。这种热变性-复性-延伸的过程就是一个PCR循环，PCR就是在合适条件下的这种循环的不断重复。第一节PCR技术原理和工作方式DenaturetemplateDNAbyheat(95oC)TargetSequenceTargetSequence①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；PCRCycle-Step1–PCRCycle-Step2–Temperatureislowered(Tm)andprimersannealtotargetsequences②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；PCRCycle-Step3-At72oCTaqDNApolymerasecatalysesprimerextensionascomplementarynucleotidesareincorporated③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链。Endofthe1stPCRCycle–Resultsintwocopiesoftargetsequence每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。TargetAmplificationNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128Amplicon1缓冲液10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，pH=8.3-9.0(室温时约为7.2)，还可能有添加剂、共溶剂等。厂商一般以10倍的贮存液形式提供。Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。厂商一般以25mmolMgCl2+形式提供，使用浓度为0.5mmol/L至2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高影响反应特异性。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTPs、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。二、PCR反应体系2、脱氧三磷酸核苷(dNTPs)dATP、dGTP、dCTP、dTTP四种的等量混合物。厂商一般提供为10mmol/L或4mmol/L的贮存液，使用浓度为0.2mmol/L左右。dNTPs浓度取决于扩增片段的长度。浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量。dNTPs可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。PCR引物的设计一般原则1.引物长度一般以18～30bp为宜，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。2.解链温度(Tm值)很重要，直接决定了扩增中可使用的退火温度(Ta值)的高低，较高时特异性增加，但退火效率下降，过低时退火效率较高，但特异性下降。两条引物间的Tm值越接近越好。计算Tm值的方法很多，简易公式为Tm=4×(G+C)+2×(A+T)，适于短于20nt的引物。长引物的Tm值计算公式见书，但比实际值往往偏低。精确的Tm计算需要考虑缓冲液的盐离子浓度和引物内部的相邻碱基的动力学参数。3、引物一般溶成10mol/L的贮存液，使用浓度为1-5mol/L。浓度过低则产量低，过高则易导致错配，PCR特异性下降。3.避免引物内部出现二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。4.要避免两个引物间特别是3’末端碱基序列互补以及同一引物自身3’末端碱基序列互补的，使它们不能形成引物二聚体或发夹结构。5.G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在40～60%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。6.引物3’末端碱基一般应与模板DNA严格配对，并且3’末端为G、C或T时引发效率较高，但3’要避免较密的C+C或G+C连排。7.引物5’末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达，但其保护碱基有一定的要求。8.引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。244、模板单、双链DNA均可。一个PCR反应中104至107个模板分子可获得较理想的效果，但由于PCR较灵敏，更少的模板分子数在循环数增加时也会得到大量扩增。不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类，模板纯度不高往往是限制PCR扩增的重要因素。不同属性的模板所加的理想的量不同，哺乳动物基因组总DNA、酵母DNA、细菌DNA、质粒、M13噬菌体作模板时，需要的量分别为1g、10ng、1ng、1pg和1%噬菌斑。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。255、耐热性的DNA聚合酶有多种，均从耐热性的细菌中分离出来，均耐高温，普遍具有5’→3’聚合酶和5’→3’外切酶活性，但在3’→5’外切酶活性(proofreading,校正功能，决定保真度,fidelity)、耐热性和附加功能上有差异。酶量增加使产量增加，但反应特异性下降，酶量过少虽能保证特异性，但影响产量。常用的有：1）TaqDNA聚合酶：最常用，来自嗜热水生菌(Thermusaquaticus)，95℃时的半衰期为40分钟，75℃时活性最强，没有校正功能，错配率为8.9×10-5至1.1×10-4。标准使用浓度一般为2.5U/50l。2）TthDNA聚合酶：来自嗜热热细菌(Thermusthermophilus)HB8，95℃时的半衰期为20分钟，74℃时进行扩增，除在Mg2+催化下进行常规的PCR扩增外，还具有在MnCl2催化下的高温反转录功能。3）VentDNA聚合酶：来自嗜热高温球菌(Thermococcuslitoralis)，100℃时的半衰期为1.8小时，具校正功能，保真度比Taq高5-15倍。264）PwoDNA聚合酶：来自嗜热细菌(Pyrococcuswoesei)，100℃时的半衰期大于2小时，有校正功能，保真度高。5）PfuDNA聚合酶：来自激烈热球菌(Pyrococcusfariosus)，具有极高的热稳定性，目前公认是最保真的。6）混合DNA聚合酶：将具有校正功能的酶与Taq酶按一定比例混合，具有类似Taq的强启动合成能力，同时又有一定的保真度，而且具有一定的扩增长片段的能力。Taq酶的延伸速度为1-2kb/min，但具有校正功能的酶的延伸速度要小些，一般只能按照600-700bp/min来预计。PCR扩增不是绝对真实的，因为具校正功能的DNA聚合酶只是比不具校正功能的DNA聚合酶相对保真而已，错配率相差在两个数量级以内。一些具校正功能的酶作PCR时，即使产物短也可能得不到产物，原因不明，估计可能与该酶的外切活性将引物降解有关。27三、PCR反应程序1、常规程序：94℃左右预变性几十秒至几分钟；94℃左右变性10秒至1分钟；50-65℃左右退火30秒至1分钟；20-35个循环72℃左右延伸30秒至几分钟；72℃左右最后延伸和加尾3-10分钟；4-25℃保持3分钟或更长。2、退火和延伸温度：退火温度Ta值由Tm值决定，多数情况下Ta采用Tm减去3-5℃，较高时特异性强但退火效率低，较低时退火效率增加而非特异扩增增加，可根据实际研究目的采用高特异性或低特异性退火。当退火温度高到与延伸温度接近时，可以将退火和延伸温度合为一个，这时PCR就由三步法变成了两步法。283、反应时间：变性步骤一般为5秒至1分钟，变性温度高时时间短，低时时间长，简单模板时间短，复杂模板时间长，尤其是直接用细胞作模板时预变性和变性时间都要长。退火时间一般为30秒至1分钟即可，引物结构好的时间短，引物结构差的退火时间宜长。延伸时间从半分钟到10分钟以上不等，由扩增片段的长度和DNA聚合酶的延伸速度共同决定。Taq扩增时按1kb/min计算，具校正活性的酶则按0.6-0.7kb/min计算。4、循环次数：多数为25-35，主要取决于模板属性、模板丰度、引物退火效率、DNA聚合酶的扩增能力。裸露DNA、杂质少、高丰度模板、引物结构好、DNA聚合酶扩增能力强时，循环数宜少，以尽量减少突变。否则宜多，以保证获得必要的PCR产物量。PCR扩增的后期循环易进入平台期，实际上是由于PCR扩增条件的逐步劣化而引起的。平台效应（plateaueffect）：PCR扩增过程后期会出现的产物的积累按减弱的指数速率增长的现象。