药物的鉴别试验方法及原理

第一章药物的鉴别试验第一节概述依据药典进行的药物分析主要有三大项：鉴别、检查和含量测定。药物的鉴别试验（identificationtest）是用于鉴别药物的真伪，在药物分析中属首项工作，只有证实被分析的药物是真的，才有必要接着进行检查、含量测定。药典所收载的药物项下的鉴别试验方法，仅适用于贮藏在有标签容器中的药物，用以证实是否为其所标示的药物。它与分析化学中的定性鉴别有所区别。这些试验方法不能赖以鉴别未知物。原料药：鉴别试验结合性状项下的外观和物理常数进行确证。一、鉴别的项目（一）性状药物的性状反映了药物特有的物理性质，一般包括外观、嗅、味、溶解度以及物理常数等。（二）一般鉴别试验（generalidentificationtest）*以药物的化学结构及其物理化学性质为依据，通过化学反应来鉴别药物真伪的。*无机药物：根据其组成的阴离子和阳离子的特殊反应，并以药典附录III项下的一般鉴别试验为依据，*有机药物：采用典型的官能团反应。*一般鉴别试验的项目：丙二酰脲类、托烷生物碱类、芳香第一胺类、有机氟化物类、无机金属盐类（钠盐、钾盐、锂盐、钙盐、钡盐、铵盐、镁盐、铁盐、铝盐、锌盐、铜盐、银盐、汞盐、铋盐、锑盐、亚锡盐）、有机酸盐（水杨酸盐、枸橼酸盐、乳酸盐、苯甲酸盐、酒石酸盐）、无机酸盐（亚硫酸盐或亚硫酸氢盐、硫酸盐、硝酸盐、硼酸盐、碳酸盐与碳酸氢盐、醋酸盐、磷酸盐、氯化物、溴化物、碘化物）。*一般鉴别试验仅供确认单一的化学药物，如为数种化学药物的混合物或有干扰物质存在时，除另有规定外，应不适用。*通过一般鉴别试验只能证实是某一类药物，而不能证实是哪一种药物。例如，经一般鉴别反应的钠盐试验，证实某一药物为钠盐，但不能辨认是氯化钠、苯甲酸钠或者是其它某一种钠盐药物。要想最后证实被鉴别的物质到底是哪一种药物，必须在一般鉴别试验的基础上，再进行专属鉴别试验，方可确认。（三）专属鉴别试验（specificidentificationtest）*根据每一种药物化学结构的差异及其所引起的物理化学特性的不同，选用某些特有的灵敏定性反应，来鉴别药物真伪的。是证实某一种药物的依据。综上所述，一般鉴别试验是以某些类别药物的共同化学结构为依据，根据其相同的物理化学性质进行药物真伪的鉴别，以区别不同类别的药物。而专属鉴别试验，则是在一般鉴别试验的基础上，利用各种药物的化学结构差异，来鉴别药物，以区别同类药物或具有相同化学结构部分的各个药物单体，达到最终确证药物真伪的目的。二、鉴别试验条件鉴别试验是以所采用的化学反应或物理特性产生的明显的易于觉察的特征变化为依据。因此，能影响鉴别试验判定结果的特征变化的因素都是应当精心选择和严格控制的。也就是说，鉴别试验应该是在规定条件下完成的，否则鉴别试验的结果是不可信的。（一）溶液的浓度主要指被鉴别药物的浓度，及所用试剂的浓度。由于鉴别试验多采用观测沉淀、颜色或各种光学参数（、、A、等）的变化，来判定结果，而药物和有关试剂的浓度会直接影响上述的各种变化，必须严格规定溶液的浓度。（二）溶液的温度温度对化学反应的影响很大，一般温度每升高10℃，可使反应速度增加2-4倍。（三）溶液的酸碱度许多鉴别反应都需要在一定酸碱度的条件下才能进行。溶液酸碱度的作用，在于能使各反应物有足够的浓度处于反应活化状态，使反应生成物处于稳定和易于观测的状态。（四）干扰成分的存在在鉴别试验中，如药物结构中的其它部分或药物制剂中的其它组分也可参加鉴别反应，产生干扰，应选择专属性更高的鉴别反应将其消除或将其分离。（五）试验时间有机化合物的化学反应和无机化合物不同，一般反应速度较慢，达到预期试验结果需要较长的时间。这是因为有机化合物是以共价键相结合，化学反应能否进行，依赖于共价键的断裂和新价键形成的难易，这些价键的更替需要一定的反应时间和条件。同时在化学反应过程中，有时存在着许多中间阶段，甚至需加入催化剂才能启动反应。因此，使鉴别反应完成，需要一定时间。三、鉴别试验的灵敏度（一）反应灵敏度和空白试验反应的灵敏度（sensitivity）:在一定条件下，能在尽可能稀的溶液中观测出尽可能少量的供试品，反应对这一要求所能满足的程度。它以两个相互有关的量，即最低检出量（minimumdetectablequantity）（又称检出限量）和最低检出浓度（minimumdetectableconcentration）（又称界限浓度）来表示。最低检出量（以m表示），就是应用某一反应，在一定的条件下，能够观测出的供试品的最小量，其单位通常用微克（g）表示（1g＝10-6g）。最低检出浓度就是应用某一反应，在一定条件下，能够观测出供试品的最低浓度，通常以1∶G（或1∶V）表示，其中G（V）表示含有1g重某供试品的溶液的g（ml）数。最低检出量和最低检出浓度之间的关系可以用下式表示，式中v为鉴别试验时，所取供试溶液的最小体积（ml）。如果选用鉴别反应的灵敏度愈高，则产生可被观测的结果所需要的药物愈少。空白试验（blanktest）:所谓空白试验，就是在与供试品鉴别试验完全相同的条件下，除不加供试品外，其它试剂同样加入进行的试验。在选用灵敏度很高的反应时，必须采用高纯度的试剂和非常洁净的器皿，才能保证鉴别试验结果的可靠性。为了消除试剂和器皿可能带来的影响，应同时进行空白试验，以供对照。（二）提高反应灵敏度的方法在实际工作中，常采用以下措施来提高反应的灵敏度。1．加入与水互不相溶的有机溶剂在鉴别试验中，如生成物具有颜色并颜色很浅时，可利用加入少量与水互不相溶的有机溶剂，浓集有色生成物，使有机溶剂中颜色变深，易于观测。2．改进观测方法例如，将目视观测溶液的颜色，改为可见分光光度法；将观测生成沉淀改为比浊度法等。第二节药物的一般鉴别试验一、鉴别方法（一）化学鉴别法1．干法将供试品加适当试剂在规定的温度条件下（一般是高温）进行试验，观测此时所发生的特异现象。(1）焰色试验:常用干法，利用某些元素所具有的特异焰色，可鉴别它们为哪一类盐类药物。方法为：取铂丝，用盐酸湿润后，蘸取供试品，在无色火焰中燃烧，使火焰显出特殊的颜色。(2)加热分解:在适当的温度条件下，加热使供试品分解，生成有特殊气味的气体。2．湿法系指将供试品和试剂在适当的溶剂中，于一定条件下进行反应，发生易于观测的化学变化，如颜色、沉淀、气体、荧光等。(1）呈色反应鉴别法：系指供试品溶液中加入适当的试剂溶液，在一定条件下进行反应，生成易于观测的有色产物。在鉴别试验中最为常用的反应类型有：1）三氯化铁呈色反应---酚羟基或水解后产生酚羟基；2）异羟肟酸铁反应---多为芳酸及其酯类、酰胺类；3）茚三酮呈色反应---脂肪氨基；4）重氮化-偶合显色反应---芳伯氨基或能产生芳伯氨基；5）氧化还原显色反应及其它颜色反应。（2）沉淀生成反应鉴别法：常用的这类反应有：１）与重金属离子的沉淀反应在一定条件下，药物和重金属离子反应，生成不同形式的沉淀；2）与硫氰化铬铵（雷氏盐）的沉淀反应多为生物碱及其盐，具有芳香环的有机碱及其盐；3）其它沉淀反应。（3）荧光反应鉴别法：常用的荧光发射形式有以下类型：1）药物本身可在可见光下发射荧光；2）药物溶液加硫酸使呈酸性后，在可见光下发射荧光；3）药物和溴反应后，于可见光下发射出荧光；4）药物和间苯二酚反应后，发射出荧光及药物经其它反应后，发射荧光。(4）气体生成反应鉴别法：1）大多数的胺（铵）类药物、酰脲类药物以及某些酰胺类药物，可经强碱处理后，加热，产生氨（胺）气；2）化学结构中含硫的药物，可经强酸处理后，加热，发生硫化氢气体；3）含碘有机药物经直火加热，可生成紫色碘蒸气；含醋酸酯和乙酰胺类药物，经硫酸水解后，加乙醇可产生乙酸乙酯的香味。（二）光谱鉴别法1．紫外光谱鉴别法常用的方法有：1）标准品对照法；2）规定吸收波长法；3）规定吸收波长和相应的吸收度法；4）规定吸收波长和吸收系数法；5）规定吸收波长和吸收度比值法。2．红外光谱鉴别法红外光谱法是一种专属性很强、应用较广（固体、液体、气体样品）的鉴别方法。1.标准图谱对照法：中国药典（1995年版）和BP(1993)2.对照品法：USP(23)。（三）色谱鉴别法利用不同物质在不同色谱条件下，产生各自的特征色谱行为（Rf值或保留时间）进行鉴别试验。常用的方法有：1.薄层色谱鉴别法在实际工作中，一般采用对照品（或标准品）比较法，要求供试品斑点的Rf值应与对照品斑点一致。2.高效液相色谱鉴别法一般规定按供试品含量测定项下的高效液相色谱条件进行试验。要求供试品和对照品色谱峰的保留时间应一致。含量测定方法为内标法时，可要求供试品溶液和对照品溶液色谱图中药物峰保留时间与内标物峰的保留时间比值应相同。3.气相色谱鉴别法方法同高效液相色谱法。4.纸色谱鉴别法纸色谱法存在分离效能低、分析时间长等缺点，在药物鉴别试验中逐渐被薄层色谱法所取代。二、鉴别试验与原理（一）有机氟化物1．鉴别试验取供试品约7mg，照氧瓶燃烧法（附录VIIC）进行有机破坏，用水20ml与0.01mol/L氢氧化钠溶液6.5ml为吸收液，俟燃烧完全后，充分振摇；取吸收液2ml，加茜素氟蓝试液0.5ml，再加12%醋酸钠的稀醋酸溶液0.2ml，用水稀释至4ml，加硝酸亚铈试液0.5ml，即显蓝紫色；同时做空白对照试验。2．试验原理有机氟化物经氧瓶燃烧法破坏，为碱性溶液吸收成为无机氟化物后，与茜素氟蓝、硝酸亚铈形成蓝紫色络合物。（二）有机酸盐1．水杨酸盐鉴别试验一取供试品的稀溶液，加三氯化铁试液1滴，即显紫色。原理本品在中性或弱酸性条件下，和三氯化铁试液生成配位化合物，在中性时呈红色，弱酸性时呈紫色；若在强酸性中，配位化合物分解生成游离水杨酸。本反应极为灵敏，只需取稀溶液进行试验，如取用量大，产生颜色过深时，可加水稀释后观察。鉴别试验二取供试品溶液，加稀盐酸，即析出白色水杨酸沉淀；分离，沉淀在醋酸铵试液中溶解。原理水杨酸不溶于水（0℃时溶解度为1g/1500L），故供试液加酸即析出游离水杨酸。由于水杨酸的酸性（K＝1.06×10-3，25℃）大于醋酸（K＝1.85×10-5，25℃），故能与醋酸铵作用释出醋酸，而本身形成铵盐溶解。析出的水杨酸亦可经冷水洗涤、干燥后测定熔点（158℃-161℃）。2．苯甲酸盐3．乳酸盐4．枸橼酸盐5．酒石酸盐6．醋酸盐鉴别试验取供试品，加硫酸和乙醇后加热，即产生乙酸乙酯的香气。（三）无机金属盐1．钠盐鉴别试验一取铂丝，用盐酸湿润后，蘸取供试品，在无色火焰中燃烧，火焰即显鲜黄色。原理钠的火焰光谱在可见光区，有589.0nm、589.6nm主要谱线，故其燃烧火焰显黄色。本焰色反应极为灵敏（最低检出限量为0.1ng钠离子）。因此，对所用仪器和试剂要求必须很严格。在检测前应将铂丝烧红，趁热浸入盐酸中，如此反复数次，直至火焰不染黄色后，再蘸取供试品进行测定。只有当强烈的黄色火焰持续数秒钟不退，才能确认为钠盐。鉴别试验二取供试品的中性溶液，加醋酸氧铀锌试液，即生成黄色沉淀。原理其反应式为：本试验中，供试品溶液应为中性；有些有机酸盐（如水杨酸钠）遇醋酸氧铀锌试液能生成有色配位化合物，故在试验前应对供试液进行预处理。其处理方法是，在供试液中加入稀盐酸，滤过，取滤液蒸干，加水溶解后，再供试验用；试验中，醋酸氧铀锌试液要加多过量；必要时，还需用玻璃棒摩擦试管壁，以促进黄色沉淀的析出。2．钾盐鉴别试液一焰色反应显紫色，但有少量钠盐混存时，须隔色玻璃透视，方能辨认。原理钾的火焰光谱在可见光区有766.49nm、769.90nm与404.4nm几条谱线，其中以766.49nm与769.90nm两条谱线最强。由于人眼在此波长附近敏感度较差，故钾盐的燃烧火焰显紫色。如有钠盐混存，因钠焰灵敏度很高，需透过蓝色钴玻璃将钠焰黄色滤去，此时火焰显粉红色。鉴别试验二取供试品，加热炽灼，除去可能含有的铵盐，放冷后，加水溶解，再加0.1%四苯硼钠溶液与醋酸，即生成白色沉淀。原理其反应式为：若有NH4+存在，显相同反应，故必须预先加热炽灼除去，以免干扰试验结果的辨认。3．铵盐鉴别试验一取供试品，加过