融合抗菌肽MAPWA和PGBD2抑制PRRSV体外增殖效应的研究

融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外增殖效应的研究白光明#,万小平#,杨璐一,高荣*（四川大学生命科学学院，生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川省动物疫病防治和食品安全重点实验室，成都，610064）摘要：为探索融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2在体外的抗病毒作用，特开展以下研究：用融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2与Marc-145细胞和PRRSV共培养，以实时定量RT-PCR技术检测Marc-145细胞中及培养液的PRRSV含量。结果发现：PRRSV感染Marc-145细胞96小时，实验组的RT-PCR检测数量均≤1.7，而阳性对照组的RT-PCR检测数量达到3.38。实验组数值显著低于阳性对照组。说明融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2能够显著减少PRRSV在Marc-145细胞的复制量；证明融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2具有明显的抗病毒效应，能显著地抑制病毒复制，减少其在靶细胞中的含量。提示：融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2分子具有显著抑制PRRSV在靶细胞内复制的作用，为开发抗病毒新型生物饲料添加剂提供了重要的参考。关键词：猪繁殖呼吸综合征病毒，融合抗菌肽，病毒复制前言猪繁殖与呼吸综合征PRRS（porcinereproductiveandrespiratorysyndrome）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）变异毒株引起的一种急性高致死性传染病，该病既能垂直传染又能水平传播，能够引起妊娠母猪流产、早产、死产、木乃伊胎、弱仔等，仔猪感染后发病率可达100%，死亡率可达50%以上[1-3]。给我国养猪业的持续发展带来了严重威胁[4]。研究发现，PRRSV病毒为一种有囊膜的单股正链RNA病毒，属于动脉炎病毒属[5]，有类似人感染人类免疫缺陷病毒（HIV）的症状，被称为动物的HIV[6]。目前对PRRSV还没有特效治疗药物，主要采取以预防为主对症治疗为辅的策略。因此，开发和研制出新型药物来治疗该病具有广阔的前景。抗菌肽是生物机体防御系统产生的对抗外界病原体感染的肽类活性物质，广泛存在于从原核生物到人类的生物体中[7]。本实验通过采用融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2与Marc-145细胞和PRRSV共培养，探索融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2对PRRSV在Marc-145细胞的增殖影响，在细胞水平上检测其对PRRS病毒的抑制作用，为进一步的动物试验提供参考和依据。#：共同第一作者：白光明（1985-），男，硕士。研究方向：神经肽类的生物学效应E-mail：[e-mail]；万小平（1987-），男，博士。研究方向：抗菌肽的作用机理E-mail：[e-mail]；*：通讯联系作者：高荣，教授，博士生导师，E-mail：[e-mail]1材料和试剂1.1融合抗菌肽MAPWA（P1）和PGBD-2（P2）基因工程酵母菌发酵上清液和MAPWA、PGBD-2酵母细胞裂解液：成都市金芝源生物技术有限公司提供；1.2Marc-145细胞：本实验室保存；1.31640RPMI细胞培养基：Sigma公司生产；1.4PRRSV：王红宁教授和周英顺博士提供。2实验方法2.1Marc-145细胞的培养从液氮罐中取出细胞冻存管，直接浸入37℃水浴中取出冻存管，用吸管吸出细胞悬液，移加到离心管中并添加10倍以上的DMEM培养基，混匀；1000-1500r/min，离心5min；弃去上清液，加入含10%小牛血清的DMEM培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，置37℃、5%CO2环境静置培养；次日更换一次培养液，继续培养。待细胞贴壁生长成致密单层后即可进行传代培养。2.2PRRSV感染Marc-145细胞培养液调节细胞悬液浓度为1×106/mL接种于12孔板中，1mL/孔。按照顺序在12孔板中分别添加MAPWA基因工程酵母菌发酵上清液（P1-1）、酵母细胞裂解分子（P1-2）、PGBD-2基因工程酵母菌发酵上清液（P2-1）和酵母细胞裂解分子（P2-2）20μL以及猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）液5μL，最后将各孔细胞培养液体积补充到2mL，置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。同时将空的Marc-145细胞与PRRSV共培养的设为阳性对照组。空的Marc-145细胞为阴性对照组。逐日观察细胞病变情况，在细胞培养24、48、72、96h时收集细胞备用。2.3实时定量RT-PCR检测PRRSV在Marc-145细胞复制的变化2.3.1Marc-145细胞RNA提取以及反转录参考RNAiso（Takara公司）试剂说明书提取收集细胞的RNA反转录：采用天根（TianGen）公司cDNA第一链合成试剂盒，20ul体系。37℃1小时。2.3.2RealtimePCR在NCBI上查找出PRRSV的基因序列，由Invitrogen公司设计并合成病毒荧光定量引物。病毒检测引物序列为：PRRSV-F：5'-TTGTGGTGTATCGTGCCG-3'PRRSV-R：5'-CAAGGAAATGGCTGGTGG-3'以细胞内保守的看家基因β-actin基因的表达作为内参标准，表达量设为1；β-ActinF：5'-CTCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3'β-ActinR：5'-CCTTCTGCATCCTGTCGGCAA-3'本实验的荧光定量PCR体系为25ulSYBRGreen反应体系，具体如下：2.0ulcDNA、1.0ul上游引物、1.0ul下游引物、12.5ulSYBRGreenPCRMasterMixed反应液，加超纯水至25ul。经过优化，最后确定实施实验的反应条件为：95℃，10s；95℃、5s，56℃、20s，72℃、15s，40个循环。2.4数据分析所有PRRSV基因表达量均是以β-actin为内参基因，最终以相对表达量来表示，相对荧光定量计算方法采用△△CT法计算而来。所有数据均采用Excel进行整理，SPSS统计软件进行统计处理，结果用平均数士标准差表示，各处理间的基因表达水平采用ANOVA分析，两处理间的差异采用t检验进行分析。3结果与分析从表1可见：PRRSV在空Marc-145细胞中的复制量随时间延长而明显增多（P0.05），显著高于用含有MAPWA和PGBD-2融合抗菌肽的酵母发酵上清液处理的细胞（P0.05）；同样，含有MAPWA和PGBD-2融合抗菌肽的酵母细胞裂解分子处理的Marc-145细胞中的PRRSV含量从24至96小时较阳性对照也显著减少（P0.05）。可见PRRSV在Marc-145细胞中的复制显著的受到MAPWA和PGBD-2的抑制，导致其病毒含量远低于阳性对照组（P0.05）(图1)。表1不同处理对Marc-145细胞中PRRSV复制含量的影响细胞培养时间（小时）P1上清+PRRSVP2上清+PRRSVP1沉淀+PRRSVP2沉淀+PRRSV阳性对照240.1938±0.0177b0.0540±0.0369c0.1588±0.0127b0.0925±0.0097c0.2592±0.0653a480.3828±0.0180b0.4046±0.0389b0.3771±0.0144b0.3607±0.0109b0.4244±0.0578a720.6505±0.0186b0.4332±0.0477c0.5547±0.0167c0.4581±0.0119c0.9651±0.1081a961.7013±0.0311b1.2653±0.0559b1.5189±0.0167b1.4459±0.0124b3.3867±0.1346a注：不相同字母的数据差异显著（P0.05）；反之，亦然（P0.05）；00.511.522.533.5424487296Marc-145细胞培养时间（小时）基因表达比值P1上清+prrsvP2上清+prrsvP1沉淀+prrsvP2沉淀+prrsv阳性对照图1MAPWA(P1)和PGBD-2(P2)处理对PRRSV在Marc-145细胞中复制的影响4结论本实验结果首次发现融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2在体外均能显著地抑制PRRSV病毒在Marc-145细胞中的复制，减少靶细胞中PRRSV的含量。提示：融合抗菌肽PGBD-2和MAPWA分子具有抑制PRRSV在靶细胞中复制的生物效应；这为今后开发新型制剂防治当今难于控制的猪PRRS疫病提供了有益的线索和科学依据。5讨论融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2基因工程酵母菌发酵上清液添加在感染PRRSV的Marc-145细胞培养液培养24到96小时，能显著抑制PRRSV的复制增殖，与阳性对照组相比，差异极为显著（P0.01）；本实验结果首次发现了融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2基因工程酵母菌发酵上清液对PRRSV复制具有明显的抑制作用。融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2基因工程酵母菌细胞裂解分子与感染PRRSV的Marc-145细胞培养液共培养，以实时定量RT-PCR技术检测Marc-145细胞及培养液中的PRRSV含量。结果首次发现：融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2基因工程酵母菌细胞裂解分子也同样能够显著减少PRRSV在Marc-145细胞中的复制量；证明融合抗菌肽MAPWA和PGBD-2基因工程酵母菌细胞裂解分子能显著地抑制PRRS病毒复制，减少其在靶细胞中的含量。实验结果提示金源肽TM具有抑制PRRSV在靶细胞复制的效应，这为新型抗病毒生物饲料添加剂的研发提供重要参考。参考文献00.511.522.533.5424487296Marc-145细胞培养时间（小时）基因表达比值P1上清+PRRSVP2上清+PRRSVP1沉淀+PRRSVP2沉淀+PRRSV阳性对照（空细胞+PRRSV）[1]刘思华,张思圆；高致病行蓝耳病防控知识（中）[J].湖南农业,2007(9):18.[2]HallWV.Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virus—asignificantdiseaseofpigs[J].AustVetJ,2005,83(5):260-261.[3]PrietoC,CastroJM.Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirusinfectionintheboar:areview[J].Theriogenology,2005,63(1):1-16.[4]杨宗照,方维焕；猪瘟合并猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)感染[J].中国兽医学报,2006,26(3):240-242.[5]DeaS,GagnonCA,MardassiH,etal.Currentknowledgeonthestructuralproteinsofporcinereproductiveandrespiratorysyndrome(PRRS)virus:comparisonoftheNorthAmericanandEuropeanisolates[J].ArchVirol,2000,145(4):659-688.[6]谢英,单天锡；猪繁殖与呼吸综合征研究进展[J].中国兽医杂志,2001,37(1):29-32.[7]GiulianiA,PirriG,NicolottoSF.Antimicrobialpeptides:anoverviewofapromisingclassoftherapeutics[J].CentralEuropeanJournalofBiology,2007,2(1):1-33.