西瓜枯萎病拮抗性放线菌的筛选与育种

西瓜枯萎病拮抗性放线菌的筛选与育种唐昕莹1,2（1南京师范大学强化培养学院,南京仙林校区，文苑路1号210046）（2南京师范大学生命科学学院实验教学中心）摘要对由山东泰安棉花耕地和浙江天目山土壤分离得到的放线菌进行筛选、育种，为西瓜枯萎病的生物防治提供潜在的可用菌种。本实验利用对峙培养法对土样中分离出的放线菌进行初筛，得到对西瓜枯萎病原菌有拮抗作用的放线菌4株，2010STF6-11、2010ZTF1-19、2010ZTF1-20、2010ZTF1-35。将所得菌种发酵液经离心获得上清液和菌体沉淀，分别经过无菌过滤、对峙培养，以确定抗生素产生位置。最后利用紫外诱变法对原始菌株诱变育种，根据H/C比值选取正突变菌种发酵培养，对发酵液采用梯度稀释法确定其最低抑制浓度（MIC）。结果表明，2010ZTF1-35抗生素产生于菌体外。选取诱变3min、诱变后H/C比值2.0的菌株2010ZTF1-35-11发酵培养，发酵液的最低抑制浓度为1×。关键词西瓜枯萎病生物防治山东泰安棉花耕地浙江天目山紫外诱变AbstractToprovidepotentialactinomycetesforbiologicalcontroloffusariumwiltofwatermelon,actinomycetesisolatedfromTai'an,ShandongandTianmumountainwerefilteredandbred.WeuseddualculturemethodtofindoutactinomyceteswhichhadantagonisticeffectstoFusariumoxysporum.Asaresult,wegot4namedas2010STF6-11,2010ZTF1-19,2010ZTF1-20and2010ZTF1-35.Thebrothwasseparatedastwoparts--supernatantandsediment,bothofwhichweresterilefiltedanddualculturedtodeterminethelocationofantibiotics.Finally,theoriginalstrainwasmutationbredbyUV.NewstrainwasselectedaccordingtoH/Cratioandtheminimuminhibitoryconcentration(MIC)wasdeterminedbydilutionmethod.Theresultsshowedthatantibioticsof2010ZTF1-35wassecretedoutofthecell.2010ZTF1-35-11whichwasmutatedbyUVfor3minuteswasselectedandtheMICoffermentationbrothwas1×.KeywordsFusariumoxysporumbiologicalcontrolcottonfieldofTai'anShandongTianmumountainofZhejiangUV西瓜枯萎病原菌属土传性的病原菌，引起的西瓜枯萎病是一种毁灭性的病害。该病菌通过土壤、种子传播，可在土壤中长期存活，防治困难，严重的地块发病率达80％以上，往往造成绝产[1-3]，给我国的西瓜生产造成严重的经济损失。对西瓜枯萎病传统的防治方法主要有抗病植株的选育[4]、嫁接[5]、药剂防治[6]和轮作套作[7]等。以上的传统方法对于该病防治都具有一定的作用，但也具局限性。例如，随着西瓜种植面积的增加，土壤资源有限，轮作困难[7]；长期的大面积药物防治易造成土壤污染并诱导病原菌产生抗药性[6][8]。新型的防治方法着眼于生物防治，由于其副作用小且有效期长而受到广泛关注[9]。近年来国内外已报道发现多种对尖孢镰刀菌具有拮抗作用的细菌、真菌、放线菌。Robert分离的非致病性尖孢镰刀菌在大田实验中能降低病害发生率35％～75％[10]；而我国的李起秦、许煜泉等也分别筛选获得对于尖孢镰刀菌有抑制作用的芽孢杆菌[11]、荧光假单孢杆菌[12]。本组以山东泰安以及浙江天目山两地的土壤为样本，分离筛选拮抗性放线菌并进行诱变育种，旨在获得对西瓜枯萎病原菌有拮抗作用的抗生素高产菌株，为生物防治提供可用菌株。1材料与方法1.1菌种本实验所用尖孢镰刀菌西瓜专化型Fusariumoxysporumf.sp.niveum由南京师范大学实验教学中心提供。本实验中本组所用放线菌菌种由山东泰安棉花耕地土样中分离得到，其中2010STF6-11已鉴定至属，为链霉菌，白孢类群。编号为2010ZTF1-19、2010ZTF1-20和2010ZTF1-35的3株放线菌由1组提供，分离自浙江天目山土样，未鉴定，菌落形态如下：2010ZTF1-19：菌落圆形，疏松，边缘整齐，中间隆起，表面有小孔，正面砖红色，反面褐色，不透明。2010ZTF1-20：菌落圆形，疏松，边缘不整齐，中间隆起，表面有小孔，正面粉白色，反面淡绿色，不透明。2010ZTF1-35：菌落圆形，致密，边缘不整齐，中间隆起，表面有小孔，正面粉红色，反面白色，不透明。1.2培养基发酵培养基：黄豆粉2%，NaCl0.1%，蛋白胨0.5%，K2HPO40.025%，可溶性淀粉2%，MgSO4·7H2O0.025%，葡萄糖0.5%，CaCO30.5%，pH7.5。高氏一号固体培养基，高氏一号液体培养基，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的配制见参考文献[13]。1.3初筛利用对峙培养法对从山东泰安棉花耕地分离所得的12株放线菌（菌种编号为2010STF6-1至2010STF6-12）进行初筛。将恒温培养7天的西瓜枯萎病原菌Fusariumoxysporum利用菌片法接种于PDA培养基中央，菌片直径约为1cm。在该接有病原菌的平板上距离中央菌片适当距离处均匀放入待检放线菌的菌片（直径约为0.6cm），每皿6株，每株2组平行，共检测12株放线菌，28℃恒温培养7天后观察结果。根据抑菌圈有无以及其大小初步筛选对西瓜枯萎病原菌具有拮抗性的放线菌。1.4复筛将1.3中初筛得到的具有拮抗性的放线菌的纯化菌种取适量接种于发酵培养基中，28℃150r/min，恒温摇床培养7天后进行鉴定。发酵培养物经离心处理（5000rpm，5min）得到上清液及沉淀物。上清液利用已灭菌的0.45μm的微孔滤膜过滤，得到无菌滤液。在离心沉淀物中以1：0.5的比例加入70%乙醇，浸提1h后用0.45μm的微孔滤膜无菌过滤，得到无菌滤液。将西瓜枯萎病原菌以菌片法接入PDA平板上，并距菌片适当位置处均匀放置已灭菌的牛津小杯，每皿4个。将上清和沉淀得到的无菌滤液分别加入牛津小杯中，每杯200μL，每份滤液2组平行。所得平板28℃恒温培养7天后，根据抑菌圈有无及其大小判断拮抗性物质的产生位置。1.5诱变育种根据1.4中复筛的结果选出拮抗性最强的菌种，进行紫外诱变。1.5.1紫外诱变将15mL无菌水加入活化菌种斜面上，洗下斜面孢子，制成孢子悬液，混匀后分装3皿，每皿5mL。每皿中加入无菌磁子。打开紫外线灯(30w)预热20min，将3份5mL的菌悬液置于离紫外线灯30cm(垂直距离)处的磁力搅拌器上照射1min，然后打开培养皿盖分别照射1min、2min、3min。诱变后每皿取1mL接种入高氏一号液体培养基中，28℃120r/min恒温摇床避光培养。1.5.2诱变结果初筛将避光培养的UV诱变菌液和未诱变的原始菌株分别经梯度稀释至10-5、10-6、10-7三个浓度，每个浓度取200μL涂布于高氏一号固体培养基上，每个稀释度2皿。28℃恒温培养7天后观察诱变结果。挑取菌落形态正常的诱变后菌落编号，转接高氏一号斜面保存菌种，转接后用打孔器得到所挑菌种的菌片，接种于中央有西瓜枯萎病原菌菌片的PDA培养基上对峙培养7天（28℃），测量菌片直径和抑菌圈直径，根据H/C值找出抑菌最明显的菌株。1.5.3抗生素的发酵及提取将1.5.2筛选出的抑菌最明显的菌株接种于10瓶发酵培养基中，每瓶50mL，28℃120r/min，恒温摇床培养6天观察结果。将发酵培养物涂片镜检，没有污染的发酵物合并，以5：2的比例加入丙酮裂解菌体，室温浸提24h。1.5.4稀释法测定发酵液MIC将1.5.3中所得浸提液过滤，滤液加入乙酸乙酯萃取，重复两次。上层脂溶性液体利用旋转蒸发仪40℃蒸发浓缩后倒入无菌培养皿中挥发7天得到干物质。将培养皿连同其中干物质整体称重，记质量为m1。利用4mL95%乙醇溶解干物质，并加水定容至10mL。转移干物质后的培养皿烘干称重，记质量为m2，m1-m2即为干物质质量。将10mL原液用0.45μm的微孔滤膜无菌过滤，滤液分别稀释至10×、50×，100×，150×四个浓度。萃取得到的下层水相挥发丙酮后用0.45μm的微孔滤膜无菌过滤，所得滤液和抗生素原液、10×、50×，100×，150×共6组，每组取200μL分别加入接有西瓜枯萎病原菌菌片的PDA培养基上的牛津小杯中，28℃对峙培养7天后根据各浓度抑菌圈有无确定发酵液的MIC。2结果与分析2.1初筛本组利用对峙培养法对分离得到的12株放线菌的拮抗性进行初筛。结果表明本组分离的12株放线菌中2010STF6-11对西瓜枯萎病原菌有拮抗性。选取该菌株以及由1组分离得到的2010ZTF1-19和2010ZTF6-20进行复筛。这3个菌株初筛结果如表1。2.2拮抗性物质性质初步鉴定为测定拮抗性物质的来源，本组将初筛得到的具有拮抗性的三组菌株发酵培养，经离心后上清和沉淀浸提液分别经无菌过滤后接种于带西瓜枯萎病原菌的PDA平板上，进行对峙培养。其结果见表1。表1拮抗性放线菌初筛复筛结果Figure1TheresultofscreeningandrescreeningofAntagonisticactinomycetes菌号属别初筛拮抗性有无初筛H/C比值上清拮抗性菌体沉淀拮抗性结论2010STF6-11链霉菌属有4.1污染无拮抗性物质可能产生于菌体外，也可能均无，需进一步鉴定2010ZTF1-19未鉴定有1.6有，拮抗圈相对较大有拮抗性物质可能产生于菌体外2010ZTF1-20未鉴定有1.5污染污染不能判断由于复筛过程中无菌滤器漏液以及本身操作的问题，致使无菌过滤不彻底，且大量平皿受到污染，不能根据该复筛结果确定放线菌中拮抗性物质的来源。其中2010ZTF1-19菌株上清液产生的拮抗圈比等量的沉淀浸提液产生的拮抗圈要大。笔者推测拮抗性物质可能存在于菌体外，即上清液中。可能由于无菌过滤不彻底，致使沉淀浸提液中也有部分拮抗性物质，但含量相对较低，故产生的拮抗圈相对较小。当然，关于这3株放线菌的拮抗性物质的性质还需进一步实验验证。本组选取未受污染的且出现拮抗圈的2010ZTF1-19菌株进行紫外诱变。2.3诱变育种为获得抗生素的高产菌株，本组采用紫外诱变法进行育种。以2010ZTF1-19为原始菌株，分别紫外诱变1min、2min、3min，摇床培养7天后梯度稀释并涂布分离。各诱变剂量的平板分离情况见表2。表22010ZTF1-19紫外诱变结果Figure2TheresultofUVmutantof2010ZTF1-19紫外诱变时间菌落形态1min菌落数多，菌落形态基本与原始菌种相同。2min菌落数较多，菌落形态大多与原始菌种相同，部分菌落变化明显；出现无色液体状菌落、直径远小于诱变前直径的菌落等。3min菌落数少，部分菌落形态变化明显，呈无色液体状。根据表2诱变后各菌落的形态以及是否为单菌落进行筛选，从诱变2min和3min的平皿中选取菌落形态正常，未失去产孢能力，且为单菌落的菌种转接PDA平板与西瓜枯萎病原菌对峙培养，确定拮抗性，共选取11株。对峙培养7天后，由于平板污染，无法测定拮抗圈大小，故放弃该菌种。采用1组分离得到的2010ZTF1-35的诱变菌株进行发酵培养。由1组实验鉴定，2010ZTF1-35的拮抗性物质产生于菌体外