红细胞血型及相关检测

2019/12/181丁肖华15903871718QQ562796013主要内容ABO血型鉴定RhD血型鉴定交叉配血试验红细胞抗体筛查及鉴定血型鉴定和交叉配血自动分析吸收放散试验教学目标•掌握ABO和Rh血型鉴定、交叉配血试验原理、方法和质量控制•熟悉红细胞不规则抗体筛查及鉴定方法•了解吸收放散试验一、ABO血型鉴定•（一）盐水介质试管法•（二）盐水介质玻片法•（三）微柱凝胶血型定型检测卡法•（四）质量保证：试管法、玻片法、卡式•（五）方法学评价•（六）临床应用•（七）不一致原因及解决方法2019/12/185ABO血型鉴定原理正向定型：已知的特异性抗体（标准血清）检查红细胞的未知抗原反向定型：已知的血型的标准红细胞检查血清中的未知抗体A抗原B抗原A和B抗原无A和B抗原抗A抗体抗B抗体抗A、抗B抗体无抗A、抗B抗体2019/12/186ABO血型鉴定结果判断正向定型（标准血清+被检者红细胞）反向定型（标准红细胞+被检者血清）结果判断抗A抗BA型红细胞B型红细胞O型红细胞+--+-A-++--B++---AB--++-O试管法试管法结果判定红细胞凝集强度判断标准瓷板法结果判定凝胶技术的原理反应室外管壁反应室底孔内套管壁凝胶或玻璃珠亲和凝胶试剂或盐水特殊粘液凝胶技术的原理：A、反应室：下端底孔很小，液体在孵育过程中不会流入下方微柱中。B、试剂或盐水层：红细胞在离心力作用下穿越该层，红细胞与反应室中的血清分离并与该层液体中的试剂反应。C、粘液：亲和柱中有一层粘液，作用与“试剂或盐水层”相同。原理：凝胶分子筛和亲和效应微柱凝胶柱中填充凝胶（葡聚糖），及相应试剂（抗体或抗原）。凝胶分子间的间隙只允许游离红细胞通过，分子排阻层析原则将发生凝集反应的红细胞阻滞于凝胶之内，而未凝集的游离红细胞则穿过微孔运动到管底，从而判定有无凝集反应。结果判定新乡医学院第三临床检验教研室微孔板法（四）质量保证试管法标记加样量、加样顺序溶血是一种阳性反应玻片法标记正定型显微镜阴性确认微柱凝胶血型定型检测卡血清标本应完全取出纤维蛋白，血浆标本建议EDTA-K2或枸橼酸盐康宁先加红细胞悬液，再加血浆或抗体试剂红细胞悬液和血浆各加50ul按照说明书操作（四）质量保证（五）方法学评价试管法：常用，广泛，较玻片法灵敏，结果准确，反应时间短，结果不能保存，人为因素大玻片法：操作简单、无需特殊仪器，适用于血型普查；灵敏度差，反应时间长，不能用于反定型，结果不能保存，人为因素影响大，易发生血液污染微柱凝胶血型定型检测卡法：特异性强、灵敏度高，结果准确，保持时间长，标本和试剂用量少，操作可以标准化、自动化，减少了医源性污染，但需要专门离心设备和试剂卡，成本较高输血治疗的首要步骤组织器官移植新生儿溶血病ABO正反定型的临床意义ABO正反定型不符分析基本程序首先重复试验重新采集献血者与受血者血液标本查询受血者既往病史及输血史和用药史等多次洗涤标本红细胞应用抗-AB、抗-A1、抗-H检测红细胞错加试剂或标本技术和操作受血者红细胞或血清ABO正反定型不一致的原因试剂失效或污染细胞与血清间比例不适当溶血现象未能识别漏加试剂结果记录或判断错误血清异常红细胞致敏近期输血疾病导致抗原减弱抗体减弱不规则抗体年龄近期进行大量血浆置换治疗RhD定型及其常见问题1.Rh定型RhD定型，试管法最经典，多使用微柱凝胶卡2.RhD阴性确认IgM抗-D阴性三个厂家IgG抗-D进行确认抗人球蛋白法进行确认三种IgG抗-D试剂均为阴性，报RhD阴性一种或一种以上IgG抗-D试剂为阳性，报弱D概念：检测受血者和供血者血液中是否含有不相配合的成分，是输血前确保受血者输血安全必不可少的试验包括：主侧配血和次侧配血主侧是受血者血清与供血者红细胞相配的一侧次侧是受血者红细胞与供血者血清相配的一侧。三、交叉配血试验交叉配血的主次侧（一）盐水介质交叉配血试验•本质凝集反应，直接凝集试验•检测IgM类抗体•方法：试管法•ABO同型配血，主侧和次侧均无凝集及溶血，表示无输血禁忌，可以输血盐水介质配血方法患者献血者主侧次侧离心看结果阳性阴性（二）抗球蛋白介质交叉配血试验抗人球蛋白试验：又称Coombs试验，是一种检查不完全抗体的敏感方法分类：直接抗球蛋白试验和间接抗球蛋白试验抗球蛋白试验原理•Coombs利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接与红细胞表面抗原结合的特异抗体，使红细胞凝集。•直接试验：是检查被检红细胞上有无不完全抗体•间接试验：是检查血清中游离的不完全抗体直接Coombs试验抗人免疫球蛋白自身抗体间接Coombs试验抗人免疫球蛋白同种异型抗体2不完全抗体可以结合在红细胞表面,但是不能和两个红细胞同时结合（致敏）。3加入抗人球蛋白1红细胞彼此之间有一定的间距4抗人球蛋白可以同时和两个不完全抗体的FC段结合，从而把红细胞连接在一起抗人球蛋白交叉配血法示意图抗球蛋白配血方法患者献血者主侧次侧37℃37℃水浴30分钟三洗抗球蛋白方法配血方法加抗球蛋白离心看结果阳性阴性结果判读•直接抗球蛋白试验•阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，被检管凝集，判定为阳性•阳性对照管凝集，阴性对照管不凝集，被检管不凝集，需要做阴性确认后判定结果（无凝集的被检管中加入IgG抗-D致敏红细胞后离心，出现凝集判阴性，否则重新试验•阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管凝集，结果不可信不发报告，分析原因重做•间接抗球蛋白试验•阳性对照管呈现凝集反应，阴性对照管未呈现凝集反应，被检管呈现凝集反应为阳性结果，被检者血清内含有抗体，如果自身对照无凝集，同种抗体；如果被检者结果阴性，被检者血清中未被查出意外抗体。•阳性对照管不凝集和（或）阴性对照管出现凝集，实验失败。结果判读抗球蛋白试剂不纯假阳性假阴性红细胞洗涤已凝集红细胞质量不抗凝标本漏加试剂红细胞、血清及试剂质量洗涤不充分操作过程不连续离心过度红细胞过多或过少血清浓度过大孵育时间和温度不当前带现象间接抗球蛋白试验盐水保存不当红细胞直抗阳性2019/12/1837（三）低离子聚凝胺介质交叉配血试验是一种快速、简便、红细胞不完全抗体的方法多数IgG抗体能够被检出，但IgG抗-K抗体除外汉族至今未发现K抗原阳性，也未检出抗-K抗体2019/12/1838聚凝胺介质试验技术•红细胞表面带有大量的负电荷，悬浮在电解质溶液中，会吸引大量阳离子，红细胞则被扩散的双层离子云所围绕，形成zeta电位。红细胞表面电荷及其相互之间的距离红细胞表面负电荷内层正电荷随红细胞移动自由移动的正电荷红细胞间由静电维持最小距离约24nm图6­2：红细胞表面电荷及其相互之间的距离2019/12/1840原理•聚凝胺技术首先利用低离子溶液（LIM）降低介质的离子强度，减少红细胞周围的电子云•再加入聚凝胺溶液，溶解后产生很多正电荷，中和红细胞表面带有的负电荷，红细胞zeta电位降低，缩短红细胞距离，产生非特异性聚集•最后加入悬浮液，具有中和聚凝胺阳离子的作用，使正常红细胞的非特异性凝集散开，特异性凝集仍然存在1红细胞间有一定间距2加入聚凝胺后，可以缩短红细胞之间的距离，使其非特异性凝集3加入枸橼酸钠，可以中和聚凝胺4红细胞的非特异性凝集消失聚凝胺交叉配血技术示意图1聚凝胺枸橼酸钠1红细胞上已有不完全抗体致敏2加入聚凝胺后，缩短红细胞之间的距离，让不完全抗体可以同时与两个红细胞结合使其特异性凝集3加入枸橼酸钠中和聚凝胺4由于不完全抗体的结合，红细胞的特异性凝集不消失聚凝胺交叉配血技术示意图2聚凝胺枸橼酸钠不完全抗体聚凝胺(Polybrene)配血方法患者献血者主侧次侧室温放置1分钟主次侧均加聚凝胺聚凝胺(Polybrene)配血方法离心聚凝胺引起红细胞非特异性凝集阳性阴性主次侧均加重悬液看结果注意事项•不能使用含枸橼酸钠和肝素抗凝标本•按比例加样，非特异凝集60秒内观察结果•出现不配合试验时，抗球蛋白重复，结果不一致时以抗球蛋白试验结果为准•一般使用血清•对Kell系统检测不理想•按照说明书方法学评价盐水介质法：适用于ABO血型交叉配血，操作简单、快速，不能检出不相配合的IgG类抗体抗球蛋白试验：结果准确，检测不完全抗体最可靠的方法，操作繁琐费事，试剂较贵低离子聚凝胺介质法：应用广泛、快速、准确，可检测IgM、IgG类抗体，需特殊试剂，操作复杂。临床应用可以发现ABO血型鉴定的错误，如A亚型发现亚型配血不合的情况发现其他血型抗体或不规则抗体四、红细胞抗体筛查与鉴定《临床输血技术规范》第四章第17条：“凡遇以下情况必须按《全国临床检验操作规程》有关规定做抗体筛选试验：1.交叉配血不合的；2.对有输血史、妊娠史或短期内需接受多次输血者为什么要开展输血前的“抗体筛选”检查1.目前已知红细胞有30个血型系统（近300个抗原）。红细胞抗原的多样性决定了抗体的多样性，检测抗A、抗B、抗D（ABO血型、Rh血型）可确保绝大多数病人的输血安全，但仍不能避免因血型不合（ABO、Rh血型以外）而引发的溶血。2.临床有的病人出现慢性（迟缓性）溶血反应，易忽视或引不起临床医师视。（理论上讲，成年人每输1U的浓缩红细胞，在不丢失、不被破坏（溶血）的前提下，应能提升Hb5-10g/L(0.5-1g/dl),保持15-30天。如果输3-4URBC，病人Hb上升不到10g/L，或几天后（1周内）Hb仍旧下降到原来水平，甚至更低。这种情况，就要考虑是否有慢性溶血反应存在。）3.利于早期发现和确认具有临床意义的抗体，充足的时间来选择相配合的血，避免患者病情的延误。什么叫“不规则抗体筛查”检查？1.不规则抗体的含义：除ABO系统外，其它系统产生的抗不符合Landsteiner规则，称为不规则抗体或意外抗体称为不规则抗体。如抗D、抗N、抗M、jk-抗体。2.“不规则抗体筛查”的含义：用具备有临床意义的血型抗原的O型红细胞，检测病人血清（含多种抗体）；如果出现聚集现象，则提示病人有不规则抗体存在，可判为“抗体筛选”阳性。不规则抗体的筛查和鉴定患者血清+试剂筛选红细胞盐水介质聚凝胺介质抗人球蛋白介质酶介质法筛选细胞要求•抗体筛选用红细胞悬液（1#、2#、3#）•试剂红细胞必须含有下列抗原：D,C,E,c,e,M,N,S,s,P1,Lea,Leb,K,k,Fya,Fyb,Jka,和Jkb，所选用的2-3个O型红细胞的抗原还应是互补的，纯合子基因所表达的抗原更有利于相应抗体的检出不规则抗体鉴定•不规则抗体筛查阳性后，进行抗体鉴定，明确抗体的类别•谱细胞与待检者血清反应，反应格局，抗体的特异性•谱细胞由广泛挑选并已详细检测血型抗原的8-16人份O型红细胞组成•一套谱细胞不可能对所有不规则抗体都进行鉴定的，鉴定困难时，更换厂商提供的谱细胞六、吸收放散试验乙醚放散法试验原理操作步骤注意事项临床应用吸收试验放散试验试验原理试剂操作步骤注意事项临床应用加热放散法试验原理操作步骤注意事项临床应用吸收试验原理待检红细胞已知效价的抗A或抗B血清吸收液已知抗原的红细胞滴定比较吸收前后血清中抗体效价红细胞上有无相应抗原及其强度间接判定待检红细胞血型及其亚型种类热放散试验原理待检红细胞分型血清物理条件的改变（加热）抗体待检红细胞试剂红细胞确定抗体的种类和强度判定待检红细胞上抗原的型别放散凝集或致敏乙醚放散试验实验原理受检者血清已知抗原的红细胞致敏已致敏红细胞乙醚放散液除去乙醚后鉴定抗体小结l输血前免疫血液学检查ABO、Rh血型定型、抗体筛查与鉴定、交叉配血l输血前免疫血液学检查检测技术盐水法、抗球蛋白法、聚凝胺介质法、微柱凝胶介质l吸收放散小测试1.检测不完全抗体的最好方法：A.酶介质法B.低离子强度溶液试验C.凝聚胺试验D.人源盐水介质试验E.抗人球蛋白试验2.聚凝胺法对大多数血型系统敏感度高且操作简便快速，但应除外:A.Kell系统B.Rh系统C.Kidd系统D.ABO系统E.Lewis系统3.直抗试验中使用的阳性对照细胞可以是：A.IgG抗体致敏红细胞B.Rh阳性红细胞C