细胞生物学实验教案09级(10-11)

2010-2011细胞生物学实验（09级）实验目录实验一细胞形态结构观察和显微测量实验二细胞膜的渗透性实验三线粒体和细胞核的分离实验四细胞的吞噬活动实验五细胞内DNA的显示实验六活体染色是细胞器（液泡系和线粒体）实验七细胞骨架的观察试验八细胞凋亡的观察实验九细胞的凝聚反应实验一、细胞形态结构的观察一、实验目的：1、熟悉动物细胞、植物细胞的基本形态结构，掌握二者之间的区别2、掌握临时装片的制作方法3、掌握显微测量的原理和方法二、实验原理：细胞是生物体结构功能的基本单位，其形态与功能相适应。不同类型的细胞具有不同的大小、形态和结构，以适应其功能。通过制作临时装片，可以观察很多细胞的结构，并借助测微尺测量细胞直径，进而获得细胞的体积。三、实验仪器、试剂及材料：仪器：光学显微镜（24台：台/人），载玻片、盖玻片（4套/人）、剪刀（1把）、镊子（1把）、牙签（50根）、滴管（个/组）试剂：1%碘液、瑞特染液材料：洋葱（红辣椒、兰草）、血细胞悬液、口腔上皮细胞四、实验步骤：1.洋葱鳞茎表皮细胞的观察（必做）在载玻片中央滴一滴1%碘液（或清水）用剪刀在洋葱鳞茎叶外表面画一个1mm2的方框用镊子撕下表皮在碘液（清水中铺平）盖上盖玻片用吸水纸吸去多余碘液（也可帮助排除气泡）显微镜下观察（必须找到细胞内呈紫色的细胞，有核最佳）质壁分离实验确认细胞壁：从载物台上取下装片，在盖玻片的一侧，滴入0.3g/mL的蔗糖溶液，另一侧用吸水纸重复吸引几次。在高倍镜下观察，可见到本来在各个细胞交界的地方都是紫色的，此时可见在细胞的角落处开始变淡，随着可见液泡变小，颜色变深，慢慢的从边角到四周完全分离开来。质壁分离复原实验：1处理：取下临时装片，在一侧滴入清水，另一侧再用吸水纸重复几次吸引，以确保洋葱表皮细胞完全浸在几乎是清水中；2观察：先在低倍镜找到一个现象质壁分离比较明显的细胞，然后换用高倍镜观察，可见和刚才相反的现象，中央液泡渐渐变大，颜色变浅，最后原生质层又和细胞壁紧紧地贴在一起。2.人口腔黏膜上皮细胞的观察在载玻片中央滴一滴1%碘液用牙签刮取上皮细胞在碘液中搅动分散细胞染色1分钟盖上盖玻片观察3.鸡红细胞观察在载玻片右端滴一滴血细胞稀释液用另一张载玻片以30~45度角（两玻片夹角）推移血液成均匀薄膜滴一滴瑞特染液染色3分钟自来水洗掉染液，晾干观察4.显微测量（至少测量一种细胞）（1）、原理：测微尺由目镜测微尺和镜台测微尺组成，目镜测微尺位于目镜内，为玻璃圆片，有刻度，但不知道每个刻度所代表的数值，这个数值是多少通过镜台测微尺确定）；镜台测微尺是一块载玻片，中央圆形区域内有一带刻度的直线，长度为1mm,一般分为100格。实验中需要核对一下。无误时每一小格代表10μm。（2）、测量：A、将镜台测微尺放入载物台上，转动目镜，使二者平行。选择一处让二者重合，然后向右侧寻找再次重合处，记下二者的数值，并按照目镜测微尺和镜台测微尺的精度关系换算目镜测微尺每小格实际代表的刻度值。B、将镜台测微尺取下，换上鸡血细胞或其他装片，用目镜测微尺测量出其长度和宽度。C、应用V=4/3Πab2（(a为长半径，b为短半径)计算出鸡血细胞的体积。注意：测量细胞时的放大倍数必须与校正测微尺时的显微镜倍数一致，否则需要重新矫正测微尺的刻度。测量至少需要测量3个以上细胞，取平均值。五、思考题1.结合实验分析细胞形态结构的特点及其与功能的适应性。2.如何使用测微尺？你会测量其他细胞如细菌的大小吗？实验二、细胞膜的渗透性一、实验目的1、了解细胞膜的渗透性2、了解各类物质进入细胞的速度。二、实验原理：细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液中，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。因此，发生溶血现象所需时间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验选用红细胞作为细胞膜透性的实验材料，将其放入不同的介质溶液中，观察红细胞的变化。三、实验仪器、试剂及材料：1.仪器：离心机（一台）、10ml试管（11只）、试管架（1个）、10ml移液管（11支）、洗耳球（11个）、eppendorf离心管（一包）、移液枪一套、枪头、滴管（11只）、记号笔等。2.试剂（1）．Alsever溶液葡萄糖2.05g柠檬酸钠(Na9C6H5O7.2H2O)0.89g氯化钠0.42g蒸馏水100ml调PH至7.2，过滤灭菌或高压灭菌10min，置4℃冰箱保存。（2）、0.128mol/LNaCl、0.128mol/LNH4Cl、0.128mol/LNH4AC、0.128mol/LNaNO3、0.09mol/LNa2SO4、0.09mol/L草酸铵、0.32mol/L葡萄糖、0.32mol/L甘油、0.32mol/L乙醇、0.32mol/L正丙醇、蒸馏水3.材料：30%鸡血细胞悬液四、实验步骤：1．从集市买一只活鸡现杀取血5ml（防止污染），放入盛有20mlAlsever’s的液瓶中，混匀（如不是实验当天使用可置冰箱保存备用，2周内使用）。2.取用Alsever’s液保存的新鲜鸡血5ml，加入8ml0.128mol/L的NaCl溶液，小心混匀，1000r/min离心3min，如此3次洗涤，最后配成30%的鸡红细胞（CRBC）悬液。3.取11支试管，做好标记，分别加入附表中所示测试溶液3ml，再滴加红细胞悬液2滴，轻轻晃动试管，观察试管中溶液颜色的变化，记录下发生溶血所需的时间。注：试管内液体分两层：上层浅黄色透明，下层红色不透明为不溶血（－）；试管内液体混浊，上层带红色者，称不完全溶血（＋或＋＋）；试管内液体变红而透明者，称完全溶血（＋＋＋）。附表1序号溶液是否溶血溶血时间1H2O2NaCl、3NH4Cl4NH4AC5NaNO36Na2SO47草酸铵8葡萄糖9甘油10乙醇11正丙醇对于不能确定是否溶血的细胞，制片于显微镜下观察，看细胞是否破碎。说明哪些溶质可渗入红细胞，哪些不能，将能渗入红细胞的物质按进入红细胞的速度快慢排序，并解释原因。五、思考题：1.结合实验阐述细胞膜的渗透性和选择透性。2.实验中有哪些注意事项？实验三、动物细胞线粒体和细胞核的分离一、实验目的：了解和掌握差速离心法分级分离细胞组分的原理和方法。二、实验原理：分离细胞组分常采用组织匀浆和差速离心的方法。在一定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于颗粒的密度、半径和悬浮介质的密度，在悬浮介质密度相同时，颗粒的密度、体积越大，其沉降速度越快。细胞内各细胞器的密度和大小都不同，依据沉降原理，依次增加离心力和离心时间，就可使细胞器按密度和体积大小分批沉降，从而实现分离。詹纳斯绿是线粒体的专一染料，它还原态无色，氧化态为蓝绿色，线粒体中的细胞色素氧化酶可将染料维持在氧化态而显蓝绿色。三、实验仪器、试剂、材料：1.实验仪器：光学显微镜（24台）、台式高速离心机（4台）、离心管（若干）、玻璃匀浆器（6个）、解剖剪（1把）、镊子（1把）、吸管（若干）、载玻片及盖玻片（若干）、八层纱布（6块）、冰块2.试剂：0.25mol/L蔗糖溶液（含0.01mol/LTris-HCl缓冲液，pH7.4）、1%詹钠斯绿染液、吉姆萨染液、95%乙醇、生理盐水3.材料：鼠肝实验步骤：将饥饿12~24小时的小白鼠处死取肝用预冷的生理盐水洗去血污称取1克肝组织放入冰上预冷的烧杯中剪碎，加入少量0.25mol/L蔗糖溶液洗去血污按4ml蔗糖溶液/克肝分批加入预冷的0.25mol/L蔗糖溶液在冰浴中用玻璃匀浆器制成肝细胞匀浆八层纱布过滤收集滤液于离心管中3000r/min离心10分钟转移上清液于新的离心管中沉淀用0.25mol/L蔗糖溶液悬浮10，000r/min离心15min4000r/min离心10min弃上清，沉淀置于冰浴，制装片B用0.5ml溶液悬浮沉淀，制片AA装片：用95%的乙醇固定5分钟晾干吉姆萨染液染色25分钟蒸馏水漂洗几秒滤纸吸干水分观察B装片：在两张载玻片上加2滴1%詹钠斯绿染液让酒精蒸发掉用牙签挑少量沉淀物于染液中染色5分钟盖盖玻片高倍镜观察(线粒体为亮绿色)注意事项：整个操作过程必须保持低温，否则影响实验结果。应尽量缩短组织匀浆时间。实验四、细胞吞噬活动的观察和活体染色一、实验目的：1.观察巨噬细胞吞噬外源细胞的过程，了解胞吞作用。2.掌握活体染色的原理和方法。二、实验原理：巨噬细胞是高等动物体内重要的免疫细胞，其具有较大的表面积，能移动和吞噬病原和异物，形成吞噬泡，然后与初级溶酶体融合把异物分解掉。巨噬细胞只有在活化后才具有较强的吞噬功能，因此实验前应先对实验动物进行腹腔淀粉注射增强免疫，以更好的观察吞噬现象。活体染色是生物学中重要的研究方法。它利用具有专一性、对细胞无毒性或毒性小的染料对生物体、生物组织、细胞进行染色以显示特异的细胞或细胞结构。根据染色方法可分为体内活染和体外活染（超活染色）。常用的有酸性染料如中性红和碱性染料如詹纳斯绿。三、实验仪器、试剂、材料：1.实验仪器：光学显微镜（24台）、注射器（10支）、吸管（2个）、剪刀（1把）、镊子（1把）、试管（4个）、载玻片及盖玻片（50套）2.实验试剂：1%血细胞悬液、3%淀粉溶液（含0.4%台盼蓝）、生理盐水3.实验材料：小白鼠四、实验步骤：1.实验前4~6天对小鼠腹腔注射1ml3%淀粉溶液；2.实验前30分钟向小鼠腹腔注射1ml1%血细胞悬液；3.用颈椎脱臼法处死小鼠，剪开腹腔，将内脏推向一侧，用吸管吸取2ml生理盐水冲洗腹腔，收集腹腔液至试管中。4.取载玻片，滴一滴腹腔液，盖上盖玻片制成临时装片。5.显微镜下暗视野观察。注意事项：1.实验前4~6天必须对小鼠进行免疫。2.腹腔洗涤液的体积不可过大，否则细胞密度降低，不易观察3.要在暗视野观察，将光强调到最大，光圈调至最小。4.在小鼠免疫4天左右观察效果最好。五、实验结果绘制观察到的吞噬现象和吞噬过程图解。实验五、细胞内DNA的显示——Feulgen反应一、实验目的1.掌握细胞内DNA显示的原理和方法。2.熟悉传统细胞化学实验的基本实验技能。二、实验原理Feulgen反应是一种特异的显示细胞内DNA的分布和含量的方法，于1924年由Feulgen发明。反应的原理是DNA经弱酸（1mol/L）水解后，打开了嘌呤和脱氧核糖连接的键，在脱氧核糖的一端形成有离的醛基。这些醛基就在原位与Schiff试剂结合，形成含醌基（紫红色）的化合物，因此凡有DNA的部位，就呈现紫红色。三、实验器材1.器具：显微镜、恒温水浴锅、盖玻片、载玻片、滴管、镊子、烧杯2.试剂：甲醇、1mol/L盐酸、Schiff试剂、亚硫酸盐溶液、1%亮绿水溶液、甘油/PBS（封片剂）3.材料：2%鸡血细胞悬液四、实验步骤1.制备血细胞途片，晾干，加甲醇固定5min。（此处设置对照，把涂片放在95℃5%三氯醋酸溶液中15min去掉DNA、RNA）2.蒸馏水过一下。3.1mol/L盐酸(60℃)水解10min。4.1mol/L盐酸（室温）1min。5.蒸馏水稍洗。6.置Schiff试剂中室温染色1小时（用改良苯酚品红染色可只染20min）。7.亚硫酸盐溶液洗3次，总时间为6min。8．自来水流水冲洗5min。9．用1%亮绿水溶液复染15秒。10.自来水流水冲洗1min。11.甘油/PBS封片剂封片；显微镜观察。五、实验结果DNA所在处显红色，细胞质显绿色。绘制观察结果图。实验六、活体染色显示液泡系（植物液泡、动物高尔基体）一、实验目的：1.掌握活体染色的原理2.掌握液泡系的显示方法。二、实验原理：活体染色是利用对细胞无毒或毒性小的染料对动、植物及其组织细胞进行染色以显示特定的细胞或细