第3章遗传物质的分子基础.

第3章遗传物质的分子基础什么是遗传物质？从1900年孟德尔论文的重新发现到1910年摩尔根的果蝇伴性遗传实验以来，生物学家一直在寻找答案。1928年Griffith等的肺炎链球菌的转化实验，1944年Avery等的单因子转化实验，1952年Hershey和Chase的噬菌体感染实验，1957年Fraenkel-Conrat等的烟草花叶病毒重建试验，先后证实DNA是遗传物质，在不具备DNA的病毒中，RNA是遗传物质，即核酸是遗传物质，是遗传信息的载体。第二个问题是，遗传物质的分子基础是什么？1953年Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型，给出了圆满的答案。第三个问题是遗传信息如何传递？基因如何表达？这得益于“中心法则”的提出和遗传密码的破译以及“DNA半保留半不连续模型”的证明。3.1.1肺炎链球菌的转化实验：DNA是遗传物质的概念源于1928年Griffith等进行的肺炎链球菌（Streptococcus引的转化实验。3.1核酸是遗传物质由于Griffith等没有做单因子转化实验，当时还不能说明起转化作用的物质是什么。pneumoniae，旧称肺炎双球菌Diplococcuspneumoniae）直到1944年Avery等三位美国科学家不仅在体外成功重复了上述实验，而且用生物化学的方法对S型菌提取液的所有成分分离后，进行单因子转化实验，证明转化因子是DNA，而不是多糖荚膜、蛋白质和RNA，而且转化频率随着DNA的纯度的提高而增加。Avery等的实验结果首次证明转化因子是DNA，取得了DNA是遗传物质的第一个和最重要的一个证据，明确了DNA是遗传信息的载体。3.1.2噬菌体感染试验：1952年Hershey和Chase用标记放射性同位素的方法，进行了噬菌体感染实验，为证明DNA是遗传物质提供了更直接的证据。噬菌体是感染大肠杆菌（E.coli）的一种噬菌体附的噬菌体，再利用捣碎机捣碎使噬菌体与大肠杆菌分开。它由蛋白质外壳和DNA核心构成。在噬菌体中，其蛋白质是唯一含硫（S）的物质，而DNA是唯一含磷（P）的物质。利用这一特性，他们在放射性32P和35S存在的情况下，使噬菌体进行繁殖，再用这种带有放射性物质标记的噬菌体去感染无放射性的大肠杆菌，几分钟后离心除去未吸对其进行离心，发现从大肠杆菌表面释放的噬菌体外壳在上清液中，它们由蛋白质组成，含有80％放射性标记35S，而大肠杆菌在沉淀中，含有80％放射性标记32P。实验表明在噬菌体感染过程中，只有DNA进入细菌细胞，而蛋白质外壳留在细菌体外。T2该实验证明具有遗传作用的是DNA而不是蛋白质。，3.1.3烟草TMV的重建试验：能感染烟草的烟草花叶病毒（tobaccomosaicvirus,TMV）由蛋白质外壳和RNA核心组成。可以从TMV病毒分别提取它的蛋白质和RNA，再将它们放在一起，可以得到具有感染力的病毒颗粒。1957年Fraenkel-Conrat等人将两个不同的MTV株系（S株系和HR株系）的蛋白质和RNA分别提取出来，然后相互对换,将S株系的蛋白质和HR株系的RNA,或反过来将HR株系的蛋白质和R株系的RNA放在一起，重建形成两种杂种病毒，去感染烟草叶片。结果是叶片上所产生的病斑跟所含RNA密切相关，是什么样的RNA就形成什么样的子代病毒粒子，即子代病毒粒子的外壳蛋白是由RNA决定的，而不是由蛋白质决定的。令人信服地证明在不具有DNA的病毒中，RNA是遗传物质。3.2核酸的分子结构3.2.1核酸的分子组成DNA和RNA都含四种主要碱基：其中腺嘌呤（adenine,A）、鸟嘌呤（guanine,G）、和胞嘧啶（cytosine,C）是两者共有，而尿嘧啶（uracil,U）为RNA特有，胸腺嘧啶（thymine,T）为DNA所特有。DNA的碱基组成具有很明显的特征，即A／T＝G／C＝1，而RNA的碱基组成一般没有这种特点。DNA和RNA都含有戊糖，其本质的区别在于它们含有的戊糖的类别不同：RNA含有D-核糖，而DNA含有2’－脱氧－D－核糖。3.2.2DNA的分子结构（1）DNA的一级结构：DNA的一级结构是指核苷酸在DNA分子中的排列顺序。在DNA的一级结构中因为各种脱氧核苷酸的脱氧核糖和磷酸都是相同的，所以碱基顺序也就代表了核苷酸顺序。生物的遗传信息通过核苷酸的不同排列顺序贮存在DNA分子中，碱基的顺序就是信息所要表达的内容，碱基顺序稍有变化，就可能引起遗传信息的很大变动，因此顺序测定对于阐明DNA的结构和功能具有更本性的意义。从这个意义上我们可以更深刻地理解基因组计划的伟大作用。（2）DNA的二级结构DNA的二级结构是指DNA通过分子间相互作用形成的双链或双螺旋分子，即DNA双螺旋结构（doublehelicalstructure）。1953年Watson和Crick根据Wilkins及Franklin对DNA纤维X射线衍射图研究证明DNA分子具有螺旋结构的信息，Chargaff等发现的DNA中碱基含量A=T，G=C，(A＋G＝T＋C)的定律，以及对四种碱基的物化数据的分析结果等，提出了著名的DNA双螺旋结构模型（double-helicalmodelofDNA）。该模型从分子水平上合理地解释了DNA的复制和转录与遗传信息的表达过程，解决了DNA的自我复制问题，巩固了DNA作为遗传物质和遗传信息载体的地位。DNA双螺旋的多态性对DNA二级结构的研究表明，在不同的湿度下DNA可以呈现不同的螺旋构型。在溶液中或在细胞的生理条件下，DNA一般为B型，但当水合的B-DNA脱水，或由于加入乙醇或盐使水的活性降低时就转变为A型。A-DNA和B-DNA都为右手螺旋，但A-DNA比B-DNA缠绕更为紧密，每圈螺旋含有11bp，螺旋轴距约为2.8nm。其他的右旋DNA还有C-,D－，E-和T-DNA等。这些不同构型的DNA其结构参数都有一定的差异变化，这种现象称为DNA结构的多态性。Z-DNA也是DNA结构多态性的一种类型与A-DNA和B-DNA不同，Z-DNA为左手双螺旋旋构型。在Z-DNA中多核苷酸链的磷酸基团绕螺旋轴的走向为锯齿形（Z字形），每圈螺旋含有12bp,每一碱基对在螺旋轴上的上升距离为0.37nm,螺旋轴距约为4.5nm,螺旋表面的小沟深，而大沟消失（图3－7B-DNA和Z-DNA双螺旋结构）。已有证据表明Z-DNA存在于天然DNA中，用针对Z-DNA的抗体已可鉴别出天然DNA中的Z-DNA区段，并有证据表明Z-DNA的存在与基因的表达调控有关，但具体在生活细胞中的功能还不清楚。（3）DNA的高级结构DNA的高级结构是指DNA的超螺旋（supercoil）结构和染色体DNA所具有的复杂折叠状态。超螺旋是DNA双螺旋的螺旋轴盘绕而形成的螺旋，是DNA三级结构的一种形式。DNA的三级结构是指双螺旋链的扭曲。例如在B-DNA双螺旋中，每10个核苷酸长度旋转一圈，这时双螺旋最稳定处于能量最低态。•生物体中绝大多数DNA以超螺旋的形式存在，比喻细菌质粒、大肠杆菌染色体、线粒体DNA、叶绿体DNA、以及哺乳类病毒基因组等。例如大肠杆菌染色体（拟核）的结构域就是一种双螺旋结构，在各结构域中若用DNA酶处理，DNA链将会断裂，双螺旋结构受到破坏，变为松弛型结构。一个闭合分子必须在DNA的每一条链上都没有断裂，既是在一条链上出现断裂都有可能导致双螺旋的消失。同样，一个分子无论是闭合还是开放结构，只要缺少双螺旋结构，就称为松弛型。负超螺旋松弛DNA正双螺旋根据DNA拓扑学原理，DNA超螺旋结构的拓扑态变化用以下数学式表示：L＝T＋WL代表拓扑连接数（linkingnumber），是双螺旋中一条链环绕另一条链盘绕的次数，只有链不发生断裂，它是一个整数；T为盘绕数（twistingnumber）,将右手螺旋定为正值，它代表DNA的一股链绕双螺旋轴所做的完整的旋转数，是DNA分子中双螺旋的数目。对B－DNA而言，它等于DNA的碱基数除以10。W表示缠绕数（writhingnumber）,也称为超螺旋数，指双螺旋分子绕超螺旋轴的次数。对于松弛型分子，W=0,L=T;对于负超螺旋，LT；对于正超螺旋，LT。在遗传学研究中，基因的转录、DNA的复制、修复与重组等均涉及到超螺旋的变化。拓扑异构酶溴乙锭拓扑异构酶溴乙锭核小体与染色质纤维的包装DNA在真核生物核小体(nucleosome)结构中的扭曲方式也是一种超螺旋结构。核小体可以组成更高层次的结构。（1）核小体是染色质的基本结构单位（2）染色质纤维的包装过程从DNA→核小体→11nm染色质小纤维→30nm染色质粗纤维→染色单体(或染色体)，总压缩比为：7×6×40×5＝8400倍。其长度压缩了近万倍3.2.3RNA的分子结构(1)tRNA分子：已经做出全序列分析的tRNA有3300种以上。tRNA都是小分子，长75－94个核苷酸，5’端有末端磷酸化基团，3’端为CCA-OH序列,分子中稀有碱基含量较高，而且许多被甲基化修饰；分子内部有碱基互补区，都能形成三叶草形二级结构。该二级结构一般由氨基酸接受臂、二氢尿嘧啶环（D环）、反密码子环和TψC环组成，有的还在反密码子环和TψC环之间存在额外环。tRNA的三级结构都为倒L形结构。（2）rRNA分子大肠杆菌的5S、16S和23SrRNA的一、二级结构分别含有120、1542和2904核苷酸。组成：5个双螺旋区和其他单链区；两个功能域：一个功能域中含有5’CGAAC序列，这是与tRNA分子TψC环上的GTψCG序列相互作用的部位，使tRNA与核糖体结合。另一个功能域与23SrRNA中的一段序列互补，对核糖体大亚基与rRNA的相互作用有重要意义。大肠杆菌5SrRNA的二级结构模型不同来源的16SrRNA具有相似的二级结构大肠杆菌16SrRNA的二级结构四个功能域：5’端功能域中心功能域3’末端大功能域3’末端小功能域。在这些功能域中有与mRNA互补的部位，有结合肽酰tRNA的部位，有些则在30S与50S亚基结合中起作用等，涉及多种识别与作用功能RNA的二级结构在基因的表达与调控过程中起着十分重要的作用例如rRNA与mRNA间的碱基配对控制着蛋白质的起始；tRNA与mRNA间的碱基配对促进翻译过程；RNA发夹结构及茎环结构控制转录的终止、翻译的效率以及mRNA的稳定性；RNA-RNA间的碱基配对在内含子的剪切过程中也起着重要的作用。近年对小分子RNA的结构和功能的研究，揭示出它们在生物的发育、生长、繁殖和基因表达与调控中的多种重要功能，这值得引起我们的关注和重视。3.3DNA复制3.3.1DNA复制的基本规律①DNA复制一般按半保留半不连续的的方式进行；②复制起始（Initiation）在原点（Origin）的特定序列上；③复制的起点处控制复制；④复制叉（Fork）的移动有单向或双向；⑤链的延伸方向只能是5’→3’方向；⑥在存在模板的条件下，DNA聚合酶以短的RNA片段作为引物开始合成DNA的短片段；⑦存在各种DNA链的合成起始机制，除了RNA引发外，还存在其它的一些机制，包括DNA链与一个末端蛋白共价结合，以及缺口的共价延伸，或者亲本链已被环出的末端等；⑧终止也是在复制过程中的某个固定点；⑨复制的机制取决于基因组结构和构象来保持产生完整的染色体；⑩即使在同一个细胞内也可进行多种复制机制的操作。半保留复制3.3.2半保留半不连续复制3.3.3环状双链DNA复制方式（1）滚环复制：滚环复制又叫σ复制λ的增殖、接合，以及真核生物rDNA的扩增都是以这种复制方式进行。（2）θ-型复制1963年Cairns对大肠杆菌DNA放射自显影实验的结果提出来的。大肠杆菌DNA双链环状分子在其DNA复制过程的中间产物，在放射自显影观察时可形成一个θ-型结构。这是由于复制从复制原点（OriC）开始，形成两个复制叉，双向复制所产生的结果。θ-型复制需要RNA引物，半保留半不连续复制。一条单链总是和模板链互补地结合在一起形成子链。（3）线粒体的D环复制哺乳动物mtDNA复制：不对称不同时的复制。先复制双链中的一条