白藜芦醇对γδT细胞增殖和杀伤肝癌细胞的增强作用

基金项目：江苏省宿迁市卫计委科研项目（NO：Z201407）＊第1页白藜芦醇对γδT细胞增殖和杀伤肝癌细胞的增强作用1.江苏省沭阳医院消化科宿迁223600;2.南京中医学院南京210023摘要[目的]：探讨白藜芦醇对人外周血γδT细胞体外增殖及该细胞对肝癌细胞SMMC-7721细胞活性的影响。[方法]：分离健康人外周血单个核细胞（PBMC），放入含有IL-2、帕米膦酸的RPMI1640培养基中培养并诱导γδT细胞，实验组给予白藜芦醇共同培养，对照组不加药物，在此基础上，两组均加入肝癌细胞SMMC-7721作为靶细胞，继续培养。在培养第10d后，用台盼蓝染色计数细胞，采用流式细胞术检测各组γδT细胞的纯度及其颗粒酶B和CD107a、穿孔素的表达；用CCK-8试剂盒检测γδT细胞对肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤效应。[结果]：两组γδT细胞纯度均达到70%以上，实验组γδT细胞较对照组（p＜0.01）纯度显著高；且实验组γδT细胞扩增倍数穿孔数、CD107a和颗粒酶B的表达及对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤效应均显著高于对照组（p＜0.01）。[结论]：白藜芦醇能促进γδT细胞增殖并可能通过上调颗粒酶B和穿孔素的表达增强其对肝癌细胞SMMC-7721细胞的杀伤效应。关键词：白藜芦醇；γδT细胞；肝癌细胞SMMC-7721；杀伤效应原发性肝癌是严重危害人类健康的主要恶性肿瘤之一，死亡率高，预后极差[1]。肝癌的发病涉及多个因素和环节，其发生和发展是一个多基因，多阶段的变化过程，而其侵袭，转移及术后复发是影响疗效和预后的重要因素。近年来的研究发现，肝癌在演变过程中可以受到某些药物的控制。肝癌对多种化疗药物不敏感或者很快耐受，并且化疗毒副作用大，因此，寻求低毒高效的天然植物成分防治肝癌成为近年研究的热点[2]。1材料与方法1.1材料rhIL-2购自厦门特宝生物工程公司；从sigma公司购买白藜芦醇、BrefeldinA、帕米膦酸；购买自Gibco公司RPMI-1640和新生牛血清培养基；从BD公司购买鼠抗人FITC标记的PerCP-Cy5.5标记的anti-CD3、anti-γδTCR、APC标记的anti-IFN-γ；采购自eBioscience公司PE标记的PE标记的anti-GranzymeB（颗粒酶B）、anti-Perforin（穿孔素）、APC标记的anti-CD107a；购买自Invitrogen公司Fix&Perm细胞破膜试剂盒；从碧云天生物技术公司购买CCK-8试剂盒购；自中国科学院上海生命科学研究所细胞资源中心采购肝癌细胞SMMC-7721；流式细胞仪购自美国BD公司；购置自Heraeus公司的CO2培养箱。1.2方法1.2.1γδT细胞培养按陈复兴[3]等的试验方法进行。采自健康献血员抗凝末梢血100Ml，加入淋巴细胞分离液，以2000r/min,离心15min,吸取单个核细胞层，生理盐水洗涤，1500r/min,离心10分钟，共3遍。加入含2×105U/LIL-2，100mL/L小牛血清。50mL/L人AB血清和3mg/LIPP的RPMI1640培养基中，调整细胞浓度为1×108/L，置于75cm2细胞培养瓶，放在37℃、5%CO2培养箱中培养,观察细胞生长情况，并根据观察的细胞生长情况及时添加培养液。收集培养10天的贴壁生长细胞进行细胞表面标志的相关试验。1.2.2γδT细胞鉴定及形态学观察应用抗CD44-FITC抗TCRγδ-FITC.和抗CD3-PE将培养10天时收集的细胞染色，进行流式细胞术检测分析，阴性对照为FITC标记的小鼠IgG。拍摄培养10天时的细胞生长状态和2.10时细胞培养瑞氏染色后的形态，进行透射电镜检查。1.2.3肝癌细胞株培养细胞复苏后，存入细胞培养瓶中，加入下拨培养液5ml,5%CO2、37℃条件下培养，每2～3天更换细胞培养液，细胞铺满瓶底时，以0.02%EDTA消化脱壁。收集细胞，1500r/min离心3min,弃去上清。1.2.3效应细胞及靶细胞的制备培养第10d后，将γδT细胞配成2×108/ml，以对数生长期的肝癌细胞SMMC-7721加入6孔细胞培养板中，每孔3ml,加入不同浓度的白藜芦醇（终浓度分别为0.2、1.56、12.5、50、100μmol/L）,同时设不加药物的对照组，继续培养48h后，收集γδT细胞为效应细胞，而肝癌细胞SMMC-7721为靶细胞，将效靶细胞分别配成2.0×109/L和2.0×108/L的细胞悬液，效靶比为10：1。1.2.5γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和CD107a表达的检测用PBS洗涤培养10d后的每组细胞2次，细胞密度调整为1×107/ml。每组取3管细胞悬液每管100μl，加入20μlFITC标记的anti-γδTCR和PerCP-Cy5.5标记的anti-CD3，室温避光孵育15min后，再加入100μl破膜试基金项目：江苏省宿迁市卫计委科研项目（NO：Z201407）＊第2页剂A，在室温避光孵育15min，用PBS洗涤后加入100μl破膜试剂B，然后在颗粒酶B测定管中加入20μlPE标记的anti-GranzymeB，穿孔素测定管中加入5μlPE标记的anti-Perforin，在室温下避光孵育15min，以400μlPBS重悬细胞，用PBS洗涤，然后上机检测颗粒酶B和穿孔素的表达。另外再取100μl细胞悬液，加入20μlPerCP-Cy5.5标记的anti-CD3、FITC标记的anti-γδTCR和APC标记的anti-CD107a，然后在室温下避光孵育15min，采用PBS洗涤，后以400μlPBS重悬细胞，然后上机检测CD107a的表达。1.2.6采用CCK-8法检测γδT细胞对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤效应实验所用靶细胞取自对数生长期的肝癌细胞SMMC-7721，在96孔板上按照5×103/孔的密度接种，以20:1的效靶比分别加入含有或无白藜芦醇诱导培养10d的γδT细胞，每一组均设空白对照组、效应细胞对照组和靶细胞对照组，每组设3个复孔。靶细胞和效应细胞共孵育24h后再加入CCK-8溶液20μl/孔，然后孵育4h后，再用酶联免疫分析仪在450nm处检测每个孔的OD值，并计算杀伤活性。杀伤活性（%）=[1－（实验组OD值－效应细胞对照组OD值）/靶细胞对照组OD值]×100%。1.3统计学分析实验结果用x±s表示，采用SPSS16.0统计分析软件进行分析。用单因素方差分析比较实验组，实验组和对照组之间的差异，P0.05我们认为差异有统计意义。2结果2.1γδT细胞纯度在诱导培养的第10d，两组γδT细胞均得到了有效的扩增，不含白藜芦醇的常规诱导培养组γδT细胞百分含量分别达到73.66±3.96%，而加入白藜芦醇组γδT细胞百分含量达到了82.44±4.61%，白藜芦醇组γδT细胞百分含量明显较无白藜芦醇的对照组高，存在显著性差异（P0.01）。（图1）。AB图1两组诱导培养第10天γδT细胞纯度A:无白藜芦醇对照组,B:白藜芦醇实验组2.2γδT细胞增殖能力在培养的第10d，白藜芦醇试验组和无白藜芦醇对照组γδT细胞数量均显著增加，扩增倍数分别为481.36±83.35、709.79±106.61，两组相比较有统计学意义（P0.01），（表1）。表1不同细胞因子组诱导10天γδT细胞的扩增组别扩增倍数无白藜芦醇对照组709.79±106.61白藜芦醇试验组481.36±83.35a注：与无白藜芦醇组相比较,aP0.012.3γδT细胞对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤效应白藜芦醇组γδT细胞在效靶比为20:1时对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤效率分别为60.55±5.53%，与无白藜芦醇对照组杀伤效率48.47±7.06%相比，有统计学意义（P0.01），（表2）。表2培养第10天γδT细胞对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤效应组别杀伤效率无白藜芦醇对照组60.55±5.53%基金项目：江苏省宿迁市卫计委科研项目（NO：Z201407）＊第3页白藜芦醇试验组48.47±7.06%a注：与无白藜芦醇组相比较,aP0.012.4γδT细胞穿孔素、IFN-γ、颗粒酶B和CD107a的表达在培养的第10天，白藜芦醇组γδT细胞穿孔素、颗粒酶B和CD107a的表达率分别为75.47±5.66%、85.62±4.59%和84.62±4.30%，较无白藜芦醇对照组的64.25±6.41%、75.44±5.03%和71.33±5.72%（P0.01）均明显增高，（图2、表3）。ABC图2诱导培养第10天γδT细胞穿孔素、颗粒酶B及CD107a的表达A:同型对照,B:无白藜芦醇对照组,C:白藜芦醇组表3培养第10天各组γδT细胞穿孔素、颗粒酶B及CD107a的表达组别perforin（%）granzymeB（%）CD107a（%）无白藜芦醇对照组64.25±6.4175.44±5.0371.33±5.72白藜芦醇试验组75.47±5.66a85.62±4.59a84.62±4.30a与无白藜芦醇组相比较,aP0.013讨论白藜芦醇，化学名3.5.4＇-三羟基芪（3.5.4-Trihydroxystilbene）,属于非黄酮类多酚化合物，1940年首次从毛叶藜芦根部分离得到，分子式为C⒕H⒓O⒊为白色针状晶体，易溶于有机溶剂，难溶于水，是植物在遇到紫外线照射，真菌感染等不利条件时产生的植物防御素，对植物本身有保护作用。白藜芦醇存在于百合科，豆科，葡萄科等70种植物中，在葡萄中含量尤为丰富，每克新鲜的葡萄皮中约含50～100μg.随着对白藜芦醇的深入研究，基金项目：江苏省宿迁市卫计委科研项目（NO：Z201407）＊第4页人们发现其具有具有抗肿瘤，防治心血管疾病，免疫调节，抗病毒，抗炎，抗衰老及雌激素样活性等多种药理作用[4-6]。γδT细胞作为机体固有免疫重要的表达γδTCR的T淋巴细胞亚群，可分泌TNF-α、IFN-γ和多种细胞因子参与适应性免疫及固有免疫的调节[7]，以MHC非限制的方式识别杀伤肿瘤细胞，近年来成为肿瘤过继性免疫治疗的重要的效应细胞[8-9]。本团队前期研究发现，白藜芦具抗炎、抗菌、抗肿瘤等功效，故此次研究在前期的基础上探讨白藜芦醇在γδT细胞活化和功能活性方面的影响，我们将白藜芦醇应用于γδT细胞培养体系中，用于观察白藜芦醇对γδT细胞体外增殖及细胞毒活性的影响，为了培养高活性γδT细胞用于肿瘤临床过继性免疫治疗提供实验依据。在此基础上，以上述γδT细胞为效应细胞，而以肝癌细胞SMMC-7721作为靶细胞进行共同培养，以期待观察白藜芦醇对γδT细胞杀伤SMMC-7721的作用效应。虽然白藜芦醇在抑制肿瘤增殖，抗炎等方面研究的较为深入，但对其免疫系统的调节作用，特别对T细胞所介导的免疫反应报道很少。目前已有实验证据表明，T细胞的行为直接影响着免疫应答的模式。从某种意义上来说，几乎所有的免疫相关疾病的发生，发展均与T细胞亚群的结构、功能、行为以及群体整合偏离有关[10-12]。白藜芦醇能够双向调节T淋巴细胞的增殖：低浓度时促进T细胞增殖，高浓度时抑制T细胞增殖，呈剂量依赖性（在0.75～6μmol/L浓度范围时）地促进小鼠T淋巴细胞的增殖和IL-2的产生[13]。关于白藜芦醇对γδT细胞增殖的影响，目前尚未见报道。本实验研究辨明，适当浓度的白藜芦醇不仅能够促进成熟γδT细胞的增殖，而且能够明显提高γδT细胞对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤活性。浓度1.56μmol/L的白藜芦醇作用48小时后，γδT细胞的杀伤活性最强，浓度大于1.56μmol/L时，其杀伤活性则呈下降趋势，说明白藜芦醇对γδT细胞的作用有浓度窗现象，为将来的临床应用提供了依据。同时，适当浓度的白藜芦醇分别作用于γδT细胞和肝癌SMMC-7721细胞48h后，γδT细胞的增值率明显高于对照组，而肝癌细胞SMMC-7721的生长抑制率较对照组无明显差别，说明实验浓度范围内的白藜芦醇能够促进γδT细胞的生长，