第三章酶的分离纯化

第三章酶的分离纯化第三章酶的分离纯化第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤第二节细胞破碎第三节酶的抽提第四节酶的纯化第五节酶的纯度与产量第六节酶的剂型与保存第一节酶分离纯化工作的基本原则及步骤1926年Summer制备了第一个结晶酶，自此以后，酶分离纯化工作进展很快，现已有数以百计的酶制成了结晶，相当数量的酶达到了高度纯净，并根据酶的作用特点，理化性质、发展了各种类型的分离纯化方法、试剂和设备。一、基本原则二、酶分离纯化的基本步骤为了能成功地进行酶的分离纯化，需注意以下两个基本原则：1.防止酶变性失效防止酶变性失效是酶分离纯化工作很重要的问题，这一点在纯化后期尤为突出。一般地，凡是用以预防蛋白质变性的方法与措施，都可考虑用于酶分离纯化工作中。常见的措施有：（1）低温：除少数例外，所有操作应在低温下进行，有有机溶剂存在时，更应注意。二、酶分离纯化的步骤酶分离纯化时，一般要经过如下步骤：1.细胞破碎：除在体液中提取酶或胞外酶，一般都要进行细胞破碎，促使胞内酶溶出，以利于抽提。2.抽提3.纯化下面分节对这三个基本环节加以介绍第二节细胞破碎细胞破碎的方法很多，有机械破碎法、物理破碎法、化学破碎法和酶学破碎法。一、机械破碎法二、物理破碎法三、化学破碎法四、酶学破碎法：通过机械运动所产生的剪切力作用，使细胞破碎的方法，称为机械破碎法，常用的有如下几种。1.机械捣碎法：利用高速组织捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力，将组织细胞破碎，转速可高达10000r/min。常用于动物内脏、植物叶芽等脆嫩组织细胞破碎，也可用于微生物，尤其是细菌的细胞破碎。此法在实验宝和生产规模均可采用。通过温度、压力、声波等各种物理因素作用，使组织细胞破碎的方法，该称为物理破碎法。物理破碎法包括如下几种方法；1.温度差破碎法：通过温度的突然变化使细胞破碎。即将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将在较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。温度差破碎法对那些较脆弱易破的细胞破碎效果较好。超声波细胞破碎的程度与输出功率和破碎时间有密切关系。同时受细胞浓度、溶液粘度，pH值、温度以及离子强度等因素的影响，必须根据细胞种类以及酶的特性加以选择。一般操作条件为：音频10kHz或20kHz；功率100、150W；温度0～10℃；pH4~-7；处理时间3～10min，最好间隔几次操作；细胞浓度和溶液粘度不宜太高，最好采用对数生长期的细胞进行破碎。超声波破碎在实验室应用具有简便、快捷、效果好等特点，特别适用于微生物细胞的破碎。但要在大规模工业生产中应用，困难很多。化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜结构改变而破坏的方法。化学破碎法中，常用的化学试剂有：有机溶剂和表面活性剂。在一定条件下，通过外加的酶或细胞自身存在的酶的作用，使细胞破碎的方法称为酶学破碎法。第三节酶的抽提酶的抽提是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。一、酶抽提的主要方法二、酶提取过程中应注意事项根据酶提取时，所采用的溶剂或溶液的不同，酶抽提的方法主要有盐溶液提取，酸溶液提取，碱溶液提取，有机溶剂提取等。1．盐溶液提取：大多数酶在一定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度增加，即盐溶，但盐浓度不能太高，否则溶解度反而降低，即盐析。故：一般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度控制在0.02—0.5mol/L。例如：用固体发酵生产的麸曲中的α--淀粉酶，糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用0.15mol／L的氯化钠溶液或0.02～0.05mol／L的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢酶用0.5～0.6mol／L的磷酸氢二钠溶液提取；有少数酶，如霉菌产生的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好。在酶的提取过程中，为了提高提取率并防止酶变性失活，须注意以下几点：1．温度：通常抽提温度应控制在0-10oC（0-4oC）。对某些耐温的酶，如胃蛋白酶等，可适当提高抽提温度，在37oC下保温抽提，效果较好。因为提高温度、可提高酶的扩散速度，增加酶的溶解度，有利于酶的提取。第四节酶的纯化一、酶纯化的一般原则二、酶纯化中常用方法概述三、沉淀分离法四、离心分离法五、过滤与膜分离六、层析分离七、电泳分离八、酶的结晶九、浓缩与干燥十、酶纯化实例三、沉淀分离法沉淀分离是通过改变某些条件，使溶液中某种溶质的溶解度降低，从而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离。在酶的分离纯化中，经常采用此法。沉淀分离的方法有很多，如盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀等。1．盐析沉淀法2．等电点沉淀法3．有机溶剂沉淀法4．复合沉淀法（选择性沉淀法）四、离心分离法离心是借助离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分离的技术，是酶的纯化过程中最为常用的一种方法。进行离心分离时，应根据欲分离物质的大小，密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。1．离心机种类及用途2．离心方法选择3.离心条件的确定五、过滤与膜分离1.概述2.粗滤3．膜分离技术六、层析分离1．概述2.吸附层析3．离子交换层析4．分子筛凝胶层析5．亲和层析七、电泳分离1、电泳基本原理2、影响电泳因素3、主要电泳技术八、酶的结晶结晶是使溶质呈晶态从溶液中析出的过程，它是酶和蛋白质等生物大分子分离，纯化方法之一。同时，结晶化合物也是生物大分子结构分析研究的材料。1、蛋白质和酶结晶条件2、结晶方法九、浓缩与干燥浓缩与干燥都是使酶与溶剂（通常是水）分离的过程，是酶分离纯化过程中不可缺少的环节之一。1.浓缩2.干燥一、酶纯化的一般原则在酶的提取液中，不可避免地杂有其它小分子和大分子物质，其中，小分子杂质在相继的纯化步骤中一般会自然地除去；而大分子杂质包括有：核酸、粘多糖、其它蛋白质。其中核酸和粘多糖易干扰后面的纯化、故最好预先除去。核酸可加硫酸链霉素，聚乙烯亚胺，鱼精蛋白或MnCl2等，使之沉淀移去，也可使用核酸酶降解。粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性剂等处理。余下就剩杂蛋白，而纯化的主要工作，也是较困难的工作，就是要将酶从杂蛋白中分离出来。在进行酶与杂蛋白分离工作时，为获得较好的分离效果，应注意以下基本原则：二、酶纯化工作中常用方法概述现有的纯化方法都是以酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上的差异以及酶的生物特性为依据而建立的，主要有如下几类：1．根据溶解度建立的方法：盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀法及选择性沉淀法，等电点沉淀法等。2．根据分子颗粒大小、重量差别建立的方法：离心法、凝胶过滤法、超过滤法。1.盐析沉淀法（1）盐析法的原理：根据球蛋白在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增加，表现为“盐溶”，而随着盐浓度继续升高，并超出某一上限时，其溶解度又会以不同速度下降，表现为“盐析”的这一特性，由于酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中，其溶解度存在差别而建立的一种纯化方法。在盐析条件下，蛋白溶解度与溶液离子强度间有如下关系：b.加固体（NH4）2SO4：当蛋白溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时，以加固体（NH4）2SO4为宜，加入量可查表，也可以下式计算：W=（g）式中：W：1升S1饱和度溶液提高到S2饱和度时，需加固体（NH4）2SO4的量（g）S2、S1：分别为需达到的和原来溶液的（NH4）2SO4饱和度，A、B：常数，与温度有关，0oC时，A=0.27、B=70720oC时,A=0.29、B=756（3）盐析时的pH控制：控制盐析pH可以提高纯化效果，一般盐析pH宜接近待纯化酶的等电点。因为等电点时，蛋白质或酶的溶解度最低，有利于盐析。另外，有些酶易与杂蛋白形成某种结合，从而干扰盐析，可控制pH5或pH9，使它们带相同电荷，以减少络合物形成，改善盐析效果。（4）盐析时温度控制：盐析温度以4oC为宜。此条件下酶溶解度低而稳定性强（5）盐析时的蛋白质浓度控制：蛋白质浓度是盐析时一个十分重要但又易被忽视的因素。一般蛋白浓度100ug/ml，盐析沉淀很难形成，而当200ug/ml蛋白浓度1mg/ml，沉淀虽能形成，但耗时，且回收率不高。因此为获得较好的盐析效果，蛋白浓度应在1mg/ml以上。b.分级沉淀：由于各种酶及某蛋白在不同浓度的盐溶液中，溶解度不同，故可采用分级沉淀法将其逐渐剥离。例如：兔肝SOD分离时，采用如下分的沉淀步骤：反抽提法为：先加（NH4）2SO4至50%饱和度，得沉淀，再将沉淀悬浮于42%饱和度（NH4）2SO4液中，溶解杂蛋白，而沉淀物即为RNA聚合酶。反抽提法较一般分级沉淀法，具有一定的优越性：①许多蛋白质从溶液中析出较为容易，是非特异性的，而要溶解却有相当高的特异性，故反抽提法可以比较细致地除去杂蛋白。②反抽提法提取，酶不易失活，可能是因为酶蛋白在非溶解状态较能抵御蛋白酶攻击的缘故。2.等电点沉淀法（1）等电点沉淀法原理：两性电解质在等电点时，溶解度最低，而不同的两性电解质是不同等电点，由此可将酶纯化。3.有机溶剂沉淀法（1）有机溶剂沉淀法原理：利用不同蛋白质在有机溶剂中溶解度不同而使之分离的方法为有机溶剂沉淀法。沉淀原理如下：a.有机溶剂降低溶液的介电常数由于分子间的引力是与溶剂的介电常数成反比，而有机溶剂能降低溶液的介电常数，加入有机溶剂，蛋白质分子间引力增加，溶解度降低。（3）温度控制：大多数蛋白质遇有机溶剂很不稳定，特别是在温度较高（室温）时，极易变性失效，故操作应在0oC以下进行。有机溶剂必须先冷到-20oC—-15oC，并在搅拌下缓慢加入，沉淀析出后应尽快在低温下离心分离。（4）pH控制：pH以接近目的酶的等电点为宜。（6）有机溶剂沉淀法的优缺点a.优点：沉淀易于分离，过滤，分辨率高，且有机溶剂易除去或回收，适用于食品工业用酶制剂的制备。b.缺点：易引起酶变性失活，故必须在低温下操作且析出沉淀要尽快分离，分离出的沉淀物应立即用水或缓冲液溶解，以尽量减少沉淀中有机溶剂的含量。4．复合沉淀法（选择性沉淀法）（1）复合沉淀法原理：在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀，再用适当方法将酶从复合物中重新析出，此即为复合物沉淀法。（2）酶沉淀剂：能与酶形成复合物沉淀的物质称为酶（蛋白质）沉淀剂，常用的有单宁、聚丙烯酸等高分子聚合物。聚丙烯酸（Polyalrylicacid，PAA）PAA+酶PAA-酶↓PAA-酶+Ca2+PAA-Ca2+↓+酶PAA-Ca2++SO42-CaSO4+PAA（可循环使用）1．离心机种类及用途（1）常速离心机：转速8000r/min，用于细胞、细胞碎片、培养基残渣及粗结晶等较大颗粒的分离。（2）高速离心机：转速10000～25000r/min，用于各种沉淀物、细胞碎片及较大细胞器的分离。（3）超速离心机：转速25000～80000r/min，有制备用、分析用、制备分析两用3种类型。用于生物大分子、细胞器、病毒等的分离纯化以及纯度检测、沉降系数和分子量的测定等。2．离心方法选择:主要有差速离心、密度梯度离心、等密度梯度离心。（1）差速离心：a.含义：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法，称为差速离心。（3）等密度梯度离心a.含义：当欲分离的不同颗粒的密度范围在离心介质的密度梯度范围内时，在离心力作用下，不同浮力密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，一直移动到与它们各自浮力密度恰好相等的位置(等密度点)，形成区带。这种方法称为等密度梯度离心。或称为平衡等密度离心。3.离心条件的确定离心分离的效果好坏与诸多因素有关。除了上述的离心机种类、离心方法，离心介质及密度梯度等以外，主要的是确定离心机的转速和离心时间。此外还要注意离心介质溶液的pH值和温度等条件。(2)离心时间离心时间依据离心方法的不同而有所差别。差速离心时间：是指某种颗粒完全沉降到离心管底的时间。等密梯度离心时间：是指颗粒完全到达等密度点的平衡时间。密度梯度离心时间：是指形成界限分明的区带的时间。对于密度梯度离心和等密度梯度离心所需的区带形成时间或平衡时间，影响因素很复杂，可通过试验后确定。（4）差速离心分离实例：差速离心分离细胞内组分1.概述（1）过滤含义：借助于过滤介质将不同大小，不同