激光共聚焦

激光扫描共聚焦显微镜原理及实际应用摘要激光扫描共焦显微镜在生物医学和材料科学的研究中日益受到重视，它以一种非侵入式的、对活体无损伤的检测手段，得到了多方面的欢迎和越来越广泛的灵活应用。LSCM是细胞神经生物学和生理学，药物学及遗传等生物医学领域的新一代研究工具。在对有机组织分层扫描后得到的“光学切片”经过三维重建后，能够测量分析出细胞形态参数和荧光强度等等。因此本文阐述了LSCM的原理及其功能，并说明其实际操作方法。关键词：激光扫描共焦显微镜原理功能实际操作激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是20世纪80年代发展起来的，是当今世界上最先进的分子生物学分析仪器之一。1969年,Dvadiiuzit[1]等提出了共焦扫描显微镜,其作原理与飞点扫描显微镜相类似,即右激发光路方面,以聚焦的激光光斑作为光源。但在探测光路方面，样品的反射光或透射光通过一个透镜聚焦到一个空间滤器上，再由探测器进行信号采集和转换,这样探测光路仅仅探测来自物空间某特定区域的光线，使得光学系统的空间分辨率得到人人的改善，并同时减小了系统的焦深,从而使得有可能对生物组织进行光学断层扫描成像。即是在传统荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外线或可见光激发荧光探针，利用计算机进行图像处理，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，以及在亚细胞水平上观察诸如Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化[2]。LSCM具有快速、实时、定性、定量、定位的进行分析测量的功能，尤其是可进行活细胞的无损伤测定，利用强大的计算机图像处理技术将一定厚度范围内的细胞或结构的虚拟光学切片进行三维重塑工作，再现细胞或组织的微细三维结构。1原理激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像（图1）在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜图1激光共聚焦显微镜原理2应用激光共聚焦显微镜与传统显微镜相比，具有高分辨率，高灵敏度，高放大率等特点，在细胞水平上可做多种功能的测量和分析，可得到真正具有三维分析的图像。同时，还可处理活的标本且不会对其造成物理化学的损害，随着软件的开发和应用技术的不断完善，激光共聚焦已成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等科学中新一代强有力的研究工具[3]。2.1原位鉴定组织或细胞内生物大分子，观察细胞及亚细胞形态结构2.1.1原位检测细胞的核酸激光扫描共聚焦显微术通过成像显示出细胞内核酸的分布特征及含量，常用于细胞核定位及形态学观察、检测细胞内DNA的复制及断裂、染色体的定位观察等。用于激光扫描共聚焦显微镜的核酸探针主要有：吖啶橙(AO)、碘化丙锭(PI)、Hoechst33342和Hoechst33258、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)等。2.1.2原位检测蛋白质、抗体及其他分子。利用免疫荧光技术可以在组织切片(细胞、染色体或亚细胞水平)原位检测出抗原分子，包括蛋白质、多肽、酶、激素、磷脂、多糖等。应用激光扫描共聚焦显微镜是目前对免疫荧光样品定位及形态观察的最佳方法。常见的利用荧光定位的方法主要是单荧光定位和多重荧光标记定位，将激光扫描共聚焦显微镜定位的精确性与抗原抗体反应的高度灵敏性结合起来，从而获得检测物质的定性、定位及定量结果。绿色荧光蛋白(GFP)已成为跟踪活组织或细胞内基因表达及蛋白质定位的标记物，激光扫描共聚焦显微镜观察GFP不仅可以分析目的基因的生物学功能和特性，还能蛋白质定位、细胞骨架研究。2.1.3检测细胞凋亡。通过观察细胞膜、核的形态、凋亡小体，TUNEL(原位末端标记法)及Annexin-V检测法，了解标记荧光的细胞的形态、检测凋亡的进程及测定细胞凋亡过程中钙的变化等，从而使细胞凋亡的结果更具说服力。2.1.4细胞器观察与测定实验目的不同，标记细胞器的方法不同。直接标记法可以直接观察细胞器形态、数量的变化。常见的探针有：DAMP、中性红标记溶酶体，二乙基草酸碳花青碘化物标记内质网，5,5’,6,6’-四乙基苯并咪唑基碳花青碘化物标记线粒体。根据不同的实验目的，选择不同的荧光探针，还可以检测细胞的融合，观察细胞骨架。2.2活细胞或组织功能的实时动态检测2.2.1细胞内钙离子、pH值和其他离子的动态分析通过一些专用荧光探针，可对细胞内钙离子、钠离子及pH值等作荧光标记，并对它们进行比率值和浓度梯度变化测定。由于细胞内钙离子为传递信息的第二信使，对细胞生长分化起着重要作用，通过单标记或双标记对细胞内钙离子和其他离子的荧光强度和分布精确测定，测定样品达到毫秒级的快速变化。借助光学切片功能可以测量样品深层的荧光分布以及细胞光学切片的生物化学特性的变化。通过不同时间段的检测可测定细胞内离子的扩散速率，了解它对肿瘤启动因子、生长因子等刺激的反应[4]。2.2.2细胞间通信和膜的流动性物和植物细胞中缝隙连接介导的细胞间通信在细胞增殖和分化中起着重要作用。通过测量细胞缝隙连接分子的转移，可以研究肿瘤启动因子和生长因子对缝隙连接介导的胞间通信的抑制作用及细胞内钙离子、pH值等对缝隙连接作用的影响，并监测环境毒素和药物在细胞增殖和分化中所起到的作用。选定经荧光染色后的细胞，借助于光漂白作用或光损伤作用使细胞部分或整体不发荧光，实时观察检测荧光的恢复过程，可直接反映细胞间通信结果。细胞膜的流动性在进行膜的磷脂酸组成分析、药物作用点和药物作用效应、测定温度反应和物种比较方面有重要作用。细胞膜荧光探针受到极化光线激发后，发射光极性依赖于荧光分子的旋转，这种有序的运动自由度取决于荧光分子周围的膜流动性，所以极性测量能间接反映细胞膜的流动性[5]。3实验操作3.1材料：培养的小鼠成骨细胞(细胞系)，盖玻片(厚度在0.13~0.17mm)；3.2试剂：PBS，4%多聚甲醛，TPBS，一抗分别为兔抗-肌动蛋白多克隆抗体，二抗分别为FITC标记抗兔Ig-G。3.3设备：激光扫描共聚焦显微镜3.4实验过程3.4.1接通总稳压器电源开关荧光显微镜：先接通透射光源(卤素灯)，调节灯电流使之适应观察样品；再接通汞稳压电源。开启汞灯后，必须使其工作1h再关闭，并需等其冷却15~20min后方可再次启动，尽量减少开关次数以延长汞灯寿命。激光器部分：检测各激光器的功率调节旋钮，使之处于最小；开启所要使用激光器的相应冷却系统；接通激光器电源，此时激光管开始工作。用激光管功率调节旋钮可调节激光管输出功率的大小。3.4.2开启扫描器电源。3.4.3打开计算机显示器及主机开关，进入操作系统。3.4.4实验观察。将洁净的盖玻片预置于培养皿中，待成骨细胞贴壁良好后取出，4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗，分别经水化、TPBS透化细胞、5%牛血清白蛋白封闭后，加入兔抗-肌动蛋白多克隆抗体，室温孵育2h，TPBS洗3次，加入FITC标记抗兔Ig-G，室温孵育1h，TPBS洗3次，甘油封片后立即进行激光扫描共聚焦显微镜观察。3.4.5关机时顺序关闭各电源关闭汞灯电源，将激光输出功率调至最小，关闭激光器电源，关闭计算机，关闭扫描器电源，关闭总稳压电源。3.5实验结果经激光共聚焦显微镜拍摄后，表明目的蛋白在细胞质中表达。（图2）图2激光共聚焦结果4讨论LSCM与传统光学显微镜的结构不同，它具备的复杂的计算机系统、激光光源系统、扫描装置和共聚焦系统。而且光学显微镜的光源一般是自然光或者是内置灯源，可见光经反光镜、聚光镜的作用,对全视野进行照明，它只能对标本局部厚度作平面成像，这样不仅要求标本为薄切片(5～10μm)，而且标本上任何一点的图像都会受到邻近点的衍射光和散色光的影响，降低了图像的反差和分辨率；而LSCM采用单色激光作为光源，并用针孔使光源成为点光源,与光学显微镜的场光源相比,LSCM的点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及平面偏振激发等独特的优点。普通光学显微镜主要缺点是分辨率受到衍射极限的限制，其分辨极限与光源波长是一个数量级；另一个缺点是它的有限焦深，它所获得的显微图像是样品前后一定厚度内所有断层图像的叠加[6]。如果要观察样品的断层图像，必须进行切片处理，并对样品进行染色，因此用普通光学显微镜很难对活的生物组织如细胞、细菌等进行动态观察。而生物医学以及材料科学的发展对显微镜提出了更高的要求，不仅希望有更高的分辨率，而且希望能对样品进行无损层析，不仅要有横向分辨率，还要有纵向分辨率，进而能观察其三维图像，这是普通显微镜所不能实现的，而动态、实时、非损伤性检测是LSCM的最大优点。5参考文献[1]吴世法.近代成像技术与图象处理.国防工业出版社.1997[2]PaddockSW.Confocallaserscanningmicroscopy.Biotechniques,1999,27(5):992-6,998-1002,1004[3]陈继,洪迪慧,郑筱祥.激光共聚焦显微镜数据的交互体绘制算法.航天医学与医学工程，2004,17(3):229-231[4]朱宜.电子显微镜的原理和使用.北京大学出版社.1983[5]李楠.激光扫描共聚焦显微术.人民军医出版社.1997[6]高万荣.新型光学显微成像技术的研究.南京理工大学博士后研究工作报告.1998