限制性内切酶和引物

一．限制性内切酶的分类：（三大类）I．I类，II类,III类.2．I类，III类为限制---修饰酶。限制性内切活性和甲基化活性，都作为亚基的功能单位包含在同一酶分子中。3．II类限制性内切酶与甲基化酶是分离的，切割位点专一，适合于DNA重组。6、同裂酶（isoschizomer）识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。具体可分为以下几种情况。①同序同切酶这些酶识别序列和切割位置都相同，如HindⅡ与HincⅡ识别切割位点为GTY↓RAC，HpaⅡ与HapⅡ识别切割位点为C↓CGG，MobⅠ与Sau3AⅠ识别切割位点为↓GATC。②同序异切酶KpnⅠ和Acc65Ⅰ识别的序列是相同的，但它们的切割位点不同，分别为GGTAC↓C和G↓GTACC。另外，Asp718Ⅰ识别和切割位点为G↓GTACC。③“同功多位”许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。如EcoRⅠ识别和切割位点为G↓AATTC，ApoⅠ识别和切割位点为R↓AATTY，后者可识别前者的序列。另外，HpaⅠ和HincⅡ的识别位点也有交叉，它们的识别和切割位点分别为GTT↓AAC和HincⅡ。④其它有些限制酶识别的序列有交叉，如在pUC系列质粒的多克隆位点中有一个SalⅠ位点（识别切割位点为G↓TCGAC），该位点也可被AccⅠ（识别切割位点为GT↓MKAC）和HincⅡ（识别切割位点为GTY↓RAC）切割。7、同尾酶许多不同的限制酶切割DNA产生的末端是相同的，且是对称的，即它们可产生相同的粘性突出末端。这些酶统称为同尾酶。这些酶切割DNA得到的产物可进行粘端连接。以下几种酶产生的末端是相同的。通过表4-3很容易判断哪些酶可产生相同的DNA末端。·EcoRⅠG↓AATCCMfeⅠC↓AATTCApoⅠR↓AATTY·SpeⅠA↓CTAGTNheⅠG↓CTAGCXbaⅠT↓CTAGA·BamHⅠG↓GATCCSau3AⅠ↓GATCStyⅠC↓CWWGG·ClaⅠAT↓CGATAccⅠGT↓MKAC（pUC19）四、III类限制修饰酶（1）亚基R，MS亚基组成。MS亚基具有识别和甲基化修饰双重作用.（2）修饰与限制取决于两亚基之间的竟争。（3）切割位点无特异性，只与识别位点的距离有关MboII识别5’-AAGA-3’切割位点5’-GAAGANNNNNNNN/N-3’3’-CTTCTNNNNNNN/NN-5’五、用于分析限制性酶切位点的网站WebMap://arbl.cvmbs.colostate.edu/molkit/mapper/index.htmlrestrictionmapper://tools.neb.com/NEBcutter2/index.php五、用于分析限制性酶切位点的软件DNAmansequencher引物的设计引物设计•引物•引物的重要性•引物设计的原则•引物与PCR•引物设计软件引物（primers)•引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。→←3’3’5’5’(Senseprimer)(Antisenseprimer)ForwardprimerReverseprimer引物的重要性•在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。引物设计的原则引物长度•一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。碱基分布的均衡性•同一碱基连续出现不应超过5个•GC含量一般40-60%–GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性–GC含量太高也易于引发非特异扩增。引物Tm值•一般要求：55℃-65℃。•计算：–对于低于20个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算–对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。•Tm=△H/(△S+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15引物二级结构•引物二聚体–尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补•发夹结构–尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。引物3’端•引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物3’端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物5’端•引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。–5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。–5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。–5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。引物的内部稳定性•过去认为，引物3’端应牢牢结合在模板上才能有效地进行延伸，故3’端最好为G或C。•现在的观点认为，引物的5’端应是相对稳定结构，而3’端在碱基配对的情况下最好为低稳定性结构，即3’端尽可能选用A或T，少用G或C。–仅仅3’端几个碱基与非特异位点上的碱基形成的低稳定性结构是难以有效引发引物延伸的。–如果3’端为富含G、C的结构，只需3’端几个碱基与模板互补结合，就可能引发延伸，造成假引发。引物设计软件•PrimerPremier5.0•Oligo•primer3•ThePrimerGenerator•NetPrimer种密码子偏好Chooseafunction引物设计界面引物搜索选项设定引物类型搜索模式5’引物位置范围3’引物位置范围产物大小范围引物长度引物信息回到主窗口引物及产物信息是否出现hairpin,dimer,falseprimingandcrossdimer引物编辑编辑引物分析引物结果确认编辑的引物