中药化学实验指导—实验十二--中药化学成分预试验

实验十二中药化学成分预试验（一）目的要求1．掌握常见中药化学成分的鉴别原理及实验技术。2．能根据实验结果，判断检品中所含化学成分的类型。3．认真做好预试验记录，正确书写实验报告。（二）试验材料本实验中的供试液（品），可根据各类成分鉴别实验的具体需要，选择有代表性的各类成分或含相应成分的药材提取物，根据实验的具体要求进行准备。需要鉴别的主要药物成分的类型有：生物碱、糖、苷、氨基酸、蛋白质、鞣质、黄酮、蒽醌、香豆素、强心苷、皂苷、挥发油、油脂、有机酸等。（三）实验原理中药中所含的化学成分很多，在提取分离某种有效成分之前，一般可先通过简单的预试验，初步了解药材中可能含有哪些类型的化学成分，以便选用适当的方法对其中有效成分进行提取、分离。预试验通常分为二类：系统预试验和单项预试验。其基本原理是利用中药中各类化学成分在不同溶剂中溶解度不同，分成数个部分，如水溶性、醇溶性及石油醚溶性等部分，再分别进行各种定性反应。各成分的检识反应可在试管或滤纸片上进行，也可用色谱法，然后根据各化学反应的现象进行分析判断，以了解试样中可能含有哪些类型的化学成分。（四）实验内容1．水溶性成分的检识取中药粗粉5g，加50ml蒸馏水，浸泡过夜，或于50～60℃水浴中温浸1小时，滤过，滤液供检识下列各类成分：（1）糖、多糖和苷类1）Molish反应：取1ml供试液于试管中，加入1～2滴10％α-萘酚乙醇试剂摇匀，倾斜试管45°，沿管壁滴加1ml浓硫酸，分成两层。如在两液层交界面出现紫红色环，表明可能含有糖、多糖或苷类。2）斐林反应：取1ml供试液于试管中，加入新配制的4～5滴斐林试剂，在沸水浴中加热数分钟，如产生砖红色氧化亚铜沉淀，表明可能含有还原糖。将上述溶液中沉淀滤过除去，滤液加1ml10％盐酸溶液，置沸水浴中加热水解数分钟，放冷后，滴加10％氢氧化钠溶液调pH至中性，重复上述斐林反应，如仍产生砖红色氧化亚铜沉淀，表明可能含有多糖或苷类。（2）氨基酸、多肽和蛋白质类1）茚三酮反应：取供试液点于滤纸片上，喷雾茚三酮试剂后，吹热风数分钟，如呈紫红色或蓝色，表明可能含氨基酸、多肽或蛋白质。2）双缩脲反应：取1ml供试液于试管中，加1滴10％氢氧化钠试剂，摇匀，再加0.5％硫酸铜溶液，边加边摇匀，如溶液呈现紫色、红紫色或蓝紫色，表明可能含有多肽或蛋白质。3）酸性蒽醌紫反应：取供试液点于滤纸片上，喷洒酸性蒽醌紫试剂，如呈现紫色，表明可能含有蛋白质。（3）酚类、鞣质类化合物1）三氯化铁反应：取1ml供试液于试管中，加醋酸酸化后，加数滴1％三氯化铁试剂，溶液如呈显绿、蓝绿、蓝黑或紫色，表明可能含有酚性成分或鞣质。2）三氯化铁-铁氰化钾反应：取供试液点于滤纸片上，干燥后，喷洒三氯化铁-铁氰化钾试剂，如立即呈现蓝色，表明可能含有鞣质。喷试剂后应立即观察，若放置一段时间，背景也能逐渐呈蓝色。如欲使纸上的斑点保存下来，在纸片仍湿润时，用稀盐酸洗涤，再用水洗至中性，置室温干燥即可。3）香草醛-盐酸反应：取供试液点于滤纸片上，干燥后，喷洒香草醛-盐酸试剂，如立即呈不同程度的红色，表明含有间苯二酚和间苯三酚结构的化合物。4）明胶-氯化钠反应：取1ml供试液于试管中，加入1～2滴明胶-氯化钠试剂，如产生白色混浊或沉淀，表明可能含有鞣质。5）咖啡碱反应：取1ml供试液于试管中，加入数滴0.1％咖啡碱溶液，如产生棕色沉淀，表明可能含有鞣质。（4）有机酸类1）pH试纸反应：取供试液，以广泛pH试纸测试，如呈酸性，表明可能含有有机酸或酚类成分。2）溴酚蓝反应：取供试液点于滤纸片上，喷洒0.1％溴酚蓝试剂的70％乙醇溶液，如在蓝色背景上产生黄色斑点，表明可能含有有机酸。如显色不明显，可再喷雾氨水，然后暴露于盐酸蒸气中，背景逐渐由蓝色变成黄色，而有机酸的斑点仍为蓝色。（5）皂苷类1）泡沫反应：取2ml供试液于试管中，剧烈振摇2分钟，如产生大量持久性泡沫，再把溶液加热至沸或加入乙醇，再振摇，如仍能产生多量持久性泡沫，表明可能含有皂苷。2）溶血反应：取供试液点于滤纸片上，干燥后，加1滴2％红细胞试液，数分钟后，如在红色背景中出现白色或淡黄色斑点，表明可能含有皂苷。本实验也可在试管中进行。2.醇溶性成分的检识取10g中药粗粉，加100ml乙醇，沸水浴中回流提取1小时，滤过。滤液回收乙醇至无醇味，取1/2量浓缩液，加10ml乙醇溶解，供甲项检识。剩余的浓缩液加10ml5％盐酸，充分搅拌，滤过，滤液部分供乙项检识。酸水不溶部分，加10ml醋酸乙酯溶解，醋酸乙酯液用5％氢氧化钠溶液振摇洗涤2次（每次2～3ml），弃去碱水层。醋酸乙酯层再用蒸馏水洗1～2次，至水洗液呈中性，弃去水洗液，置于水浴上蒸发除去醋酸乙酯，残留物用15ml乙醇溶解，供丙项检识。甲项检识（1）鞣质类：同水溶性成分检识（2）有机酸类：同水溶性成分检识（3）黄酮类1）盐酸-镁粉反应：取1ml供试液于试管中，加镁粉适量，摇匀，加2～5滴浓盐酸，即产生剧烈反应，如溶液呈红色或紫红色，表明可能含有黄酮类。2）三氯化铝反应：取供试液点于滤纸上，晾干，喷雾三氯化铝试剂，干燥后，斑点呈鲜黄色，如在紫外灯下观察，斑点有明显的黄绿色荧光，表明可能含有黄酮类。3）氨熏反应：取供试液滴于滤纸片上或硅胶色谱板上，置氨气中熏片刻，斑点呈亮黄色，在紫外灯下观察，斑点呈黄色荧光，表明可能含有黄酮类。（4）蒽醌类化合物1）碱液反应：取1ml供试液于试管中，加10％苛性碱试剂呈红色，如加酸使成酸性，则红色褪去，表明可能含有蒽醌类。2）醋酸镁反应：取1ml供试液于试管中，加数滴1％醋酸镁甲醇溶液，如溶液呈橙红色、紫色等颜色，表明可能含有蒽醌类。（5）甾体和三萜类1）醋酐-浓硫酸反应：取1ml供试液，置蒸发皿中水浴蒸干，加1ml冰醋酸使残渣溶解，再加1ml醋酐，最后加1滴浓硫酸，如溶液颜色由黄→红→紫→蓝→墨绿，表明可能含有甾体类成分。如溶液最终呈现红或紫色，表明含有三萜类成分。2）三氯醋酸反应：取供试液滴于滤纸片上，滴三氯醋酸试剂，加热至60℃，产生红色，渐变为紫色，表明含甾体类成分。加热至100℃才显红色、红紫色，表明含有三萜类成分。3）氯仿-浓硫酸反应：取1ml供试液，置于蒸发皿中水浴蒸干，加1ml氯仿使残渣溶解，将氯仿液转入试管中，加1ml浓硫酸使其分层，如氯仿层显红色或青色，硫酸层有绿色荧光，表明可能含有甾体或三萜。乙项检识（1）生物碱类1）碘化铋钾反应：取1ml供试液于试管中，加1～2滴碘化铋钾试剂，如立即有棕黄色至棕红色沉淀产生，表明可能含有生物碱。2）碘化汞钾反应：取1ml供试液于试管中，加2～3滴碘化汞钾试剂，如产生白色或类白色沉淀，表明可能含有生物碱。3）碘-碘化钾反应：取1ml供试液于试管中，加2～3滴碘-碘化钾试剂，如产生褐色或暗褐色沉淀，表明可能含有生物碱。4）硅钨酸反应：取1ml供试液于试管中，加1～2滴硅钨酸试剂，如产生黄色沉淀或结晶，表明可能含有生物碱。丙项检识（1）强心苷类1）碱性苦味酸反应：取1ml供试液于试管中，加数滴碱性苦味酸试剂，如溶液即刻或15分钟内显红色或橙红色，表明可能含有强心苷类。2）间二硝基苯反应：取1ml供试液于试管中，加数滴间二硝基苯试剂，摇匀后再加数滴20％氢氧化钠，如产生紫红色，表明可能含有强心苷类。3）冰醋酸-三氯化铁反应：取1ml供试液于蒸发皿中，水浴上蒸干，残留物加0.5ml冰醋酸-三氯化铁试剂溶解后，置于试管内，沿管壁加入1ml浓硫酸，使分成二层，如上层为蓝绿色，界面处为紫色或红色环，表明可能含有2,6-二去氧糖的强心苷类。4）呫吨氢醇反应：取1ml供试液于蒸发皿中，水浴上蒸干，加呫吨氢醇试剂，置水浴上加热2分钟，如溶液显红色，表明可能含有2,6-二去氧糖的强心苷类。本实验也可取强心苷固体试样少许，加入1ml呫吨氢醇试剂振摇，置水浴上加热3分钟，如呈现红色，表明可能含有2,6-二去氧糖。（2）香豆素、内酯类1）异羟肟酸铁反应：取1ml供试液于试管中，加7％盐酸羟胺醇溶液及10％氢氧化钠溶液各2～3滴，置沸水浴上加热数分钟至反应完全，放冷，加1％盐酸调pH3～4，再加1～2滴1％三氯化铁试剂，如溶液为红色或紫色，表明可能含有香豆素或内酯类。2）开环-闭环反应：取1ml供试液于试管中，加2～3滴1％氢氧化钠溶液，于沸水浴上加热3～4分钟，得澄清溶液，再加3～5滴2％盐酸使溶液酸化，如溶液变为混浊，表明可能含有内酯类化合物。3）重氮化偶合反应：取1ml供试液于试管中，加数滴5％碳酸钠试剂，于沸水浴上加热数分钟，冷后，加数滴新配制的重氮盐试剂，如呈红色或紫色，表明可能含有香豆素类化合物。4）间硝基苯反应：取供试液点于滤纸片上，喷洒2％间硝基苯试剂，待乙醇挥发后，再喷洒2.5mol/L氢氧化钾溶液，置70～100℃的恒温箱中加热，如呈紫红色，表明可能含有内酯类化合物。本试验也可在试管中进行。5）荧光反应：取供试液，点于滤纸片上或硅胶色谱板上，干燥后置紫外灯下观察，如呈现蓝-绿色荧光，再喷洒1％氢氧化钾试剂，荧光加强，表明可能含有香豆素类化合物。3.石油醚溶性成分的检识取2g中药粗粉，加10ml石油醚，室温下浸渍提取2～3小时，滤过，滤液作下列成分检识。（1）甾体、三萜类：同醇溶性成分甲项检识。（2）挥发油、油脂类1）油斑试验：取供试液点于滤纸片上，室温下挥去溶剂后，滤纸片上如留有油斑，表明可能含有油脂或挥发油，若稍经加热，油斑消失或减少，表明可能含有挥发油，如油斑无变化，表明可能含有油脂。2）香草醛-浓硫酸反应：取供试液点于硅胶色谱板上，挥去石油醚，喷洒香草醛-浓硫酸试剂，如产生红、蓝、紫等颜色，表明可能含有挥发油、萜类和甾醇。4.氰苷类成分的检识（1）苦味酸钠反应：取1g试样，捣碎，置于试管中，加数滴蒸馏水使湿润，于试管中悬挂一条苦味酸钠试纸（勿使试纸接触试管下部试样），用胶塞塞住试管，于50～60℃水浴中加热15～30分钟，，如试纸由黄色变为砖红色，表明可能含有氰苷。（2）普鲁士蓝反应：取1g试样，捣碎，置于试管中，加蒸馏水使湿润，立即用滤纸将试管口包紧，并在滤纸上加1滴10％氢氧化钾溶液，于50～60℃水浴中加热15～30分钟，再在滤纸上分别滴加10％硫酸亚铁试剂、10％盐酸、5％三氯化铁试剂各1滴，如滤纸显蓝色，表明可能含有氰苷。5.实验说明及注意事项（1）本实验所用的供试品，可根据具体情况，灵活选择，但应包括试验材料项中所列出的成分，提倡尽可能使用有代表性的化学对照品。（2）预试验反应完成后，首先对反应结果明显的成分进行分析判断，作出初步结论。而对某些反应结果不十分明显的，应进一步浓缩处理供试液，再进行检识或另选一些试剂进行检识，有时可配合色谱法检识。（3）判断分析各反应结果时，应综合考虑，例如异羟肟酸铁反应为阳性的有酯、内酯、香豆素类等化合物，要配合香豆素的特有反应，将香豆素与其他酯类化合物进行区别。（4）预试验结果一般只能提供试样中可能含有哪些类型的化学成分，然后设计提取分离的工艺方法，通过对提取分离得到的成分进一步检识，才能确定该药材中含有哪些成分。6.思考题（1）中药化学成分预试验有何实际意义？在判断预试验结果时应注意哪些问题？（2）怎样才能提高预试验的准确性和灵敏度？在具体操作中应注意哪些问题？