海洋生物功能基因表达与分析实验

海洋生物功能基因表达与分析实验实验一：海洋生物功能基因生物信息学分析实验二：蛋白质Ni柱亲和层析实验三：活性蛋白质测定与分析实验四：SDS-PAGE检测蛋白纯度实验一·海洋生物功能基因生物信息学分析生物信息学分析就是利用在线软件对测序后已知的核苷酸或氨基酸序列进行分析，从而预测蛋白质的部分理化性质，结构与功能等。主要实验方法：1.基因全长序列分析：对于给定的DNA序列进行分子生物学分析。通过NCBI的OpenReadingFrameFinder（）分析可知：给定的基因序列全长，及能编码氨基酸数量。2.蛋白理化性质预测与分析：根据在线服务系统ExPASy中的ProtParam工具()和Proscale工具()进一步对目的基因蛋白氨基酸序列的基本理化性质进行综合预测分析，结果比较可靠。预测的理化性质有：蛋白分子量(Molecularweight)、理论等电点(TheoreticalpI)、氨基酸组成(Aminoacidcomposition)、电荷分布(negativelychargedresidues,positivelychargedresidues)、原子构成(Atomiccomposition)、消光系数(Extinctioncoefficients)、半衰期(Estimatedhalf-life)、不稳定系数(Instabilityindex)，脂肪系数(Aliphaticindex)、总平均疏水性(Grandaverageofhydropathicity,GRAVY)等。3.磷酸化位点预测与分析：磷酸化和去磷酸化是细胞内信号传导的重要方式，应用在线服务NetPhos2.0Serve()对目的基因的磷酸化位点进行预测与分析，对蛋白序列中的Ser、Thr和Tyr三种氨基酸残基可能成为的磷酸化位点作出预测。4.蛋白卷曲螺旋结构的预测与分析：利用在线服务Coils分析工具()对目的基因蛋白序列形成卷曲螺旋的倾向性进行预测，以window=14，21和28为实验参数，按照几率50%就可形成螺旋的规则，比较不同权重情况下的分析结果。5.蛋白质二级结构预测与分析：蛋白质二级结构主要有α-螺旋、β-折叠、β-转角等几种形式，它们是构成蛋白质高级结构的基本要素。应用JPred（）和PredictProtein()预测服务器对目的基因蛋白进行二级结构预测。6.蛋白的跨膜结构预测与分析：跨膜结构域的预测和分析，对正确认识和理解蛋白质的功能、结构、分类、方位及细胞中作用部位均有着重要的指示意义。应用在线服务TMHMM()和Tmpred()对目的基因蛋白的跨膜结构进行预测及分析。红色表示跨膜区，蓝色即在膜内部，相反紫色细线表示在膜外的概率。7.信号肽的预测和分析：预测和分析信号肽有助于蛋白质功能域的划分和蛋白质细胞定位。应用在线服务SignaIP4.1Server()对目的基因的信号肽进行预测与分析。8.亚细胞定位预测与分析：亚细胞定位与蛋白质的功能存在着非常重要的联系，可以通过氨基酸组成进行亚细胞定位的预测。应用PSORT()软件对目的基因蛋白的亚细胞内定位进行预测。[这个网站需要翻墙才能登陆，可以试一下，不一定能打开。9.三维结构的预测和分析：蛋白质依赖于其三维结构的形状和关键功能域的性质来实行生物功能。利用Phyre在线工具(=index)对目的基因氨基酸序列进行蛋白质三维结构预测。10.保守结构域与功能域分析：根据NCBI-CDS()和Prosite()对目的基因蛋白的保守结构域与功能域进行在线分析。11.同源蛋白质家族比较分析：应用InterProScan程序搜索位于EBI的InterPro数据库（）进行同源蛋白质分析比较。12.分子系统发育预测与分析：(1)首先对目的基因的氨基酸序列进行BLAST分析。应用NCBI的BLAST在线工具（）进行在线BLAST分析，检索并选取若干与给定目的基因相似度较高的基因进行下载，尽量不要选带SP.（未知菌）的菌株基因，选择typical菌株的基因，并且选取时主要不要选择染色体基因。下载时选定Fasta格式，得到txt文件，打开该文件，并进行编辑，主要是菌株及基因名称及genbank编号等。(2)打开BioEdit软件，并打开下载好的txt文件。选择AccessoryApplication，选择ClustalWMultiplealignment，及RunClustalW，保存文件untitled.fas。(3)打开MEGA软件，打开untitled.fas文件，确认进行分析。选择NucleotideSequences，并确认，不进行核苷酸序列的蛋白质编码。选择phylogeny，选择第二个Construct/TestNeighbor-JoiningTree即可。之后进行保存，并可用AI等软件进行修饰。13.基因功能的预测与分析：应用在线软件InterPro()对目的蛋白参与的生物过程、分子功能进行预测与分析。注意事项：1.部分网站可能会出现打不开的情况，搜索网站前面的英文单词（如“基因功能的预测与分析：应用在线软件InterPro()对目的蛋白参与的生物过程、分子功能进行预测与分析。”中如果网站打不开，就搜索InterPro）找到相关网站，也可达到同样的效果。2.以上在线分析网站及软件大部分需要Fasta格式，Fasta格式的序列获取方法我单独建了个文档，在这里就不详细阐述。实验二·蛋白质Ni柱亲和层析一．实验目的：利用Ni柱亲和层析，对蛋白质进行分离、纯化。二．实验原理：通常为了方便纯化异源表达的目的蛋白质，会在目的基因末端添加一段组氨酸序列标签。由于组氨酸内含有的咪唑侧链可与镍、锌等金属离子亲和结合，因此目的蛋白可在中性或弱碱性条件下结合于树脂上，并在低pH下被咪唑竞争洗脱。选择组氨酸作为蛋白标签主要是因为：（1）该标签分子量很小，只有6个组氨酸，通常不需要去除；（2）在高浓度尿素和胍的变性纯化条件下仍能保持较好的结合力；（3）无免疫原性。因而利用Ni柱可以对目的蛋白进行有效分离、纯化。三．实验材料：1.培养基：LB培养基（1000mL）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，固体培养基需加15g琼脂，5NNaOH调pH至7.0，121ºC湿热灭菌20min。包括LB液体摇瓶培养基以及LB液体试管培养基。2.相关溶液配制：①0.1g/mLKana的配制：0.1gKana粉末+1mL灭菌ddH2O，混匀于-20ºC保存备用；②IPTG的配制：0.4gIPTG粉末+1mL灭菌ddH2O，混匀于-20ºC保存备用；③高缓冲液：6.06gTris，0.4gSDS，90mL灭菌ddH2O，用4NHCl调pH为6.8，定容至100mL，混匀于4ºC保存备用；④50mM磷酸缓冲液pH6.8：称取NaH2PO4•2H2O10.86105g，NaH2PO4•2H2O6.08595g，用水定容至1L。⑤Binding/washbuffer（10mM咪唑）：14.625gNaCl，3.5814gNa2HPO4，0.34g咪唑，溶于450mL的灭菌ddH2O中，调节pH为7.4定容至500mL，混匀于4ºC保存备用。⑥Elutionbuffer（40mM咪唑）：7.3125gNaCl，1.7907gNa2HPO4，0.68g咪唑，溶于200mL的灭菌ddH2O中，调节pH为7.4定容至250mL，混匀于4ºC保存备用。⑦Elutionbuffer（100mM咪唑）：7.3125gNaCl，1.7907gNa2HPO4，1.7g咪唑，溶于200mL的灭菌ddH2O中，调节pH为7.4定容至250mL，混匀于4ºC保存备用⑧Elutionbuffer（250mM咪唑）：14.625gNaCl，3.5814gNa2HPO4，8.5g咪唑，溶于450mL的灭菌ddH2O中，调节pH为7.4定容至500mL，混匀于4ºC保存备用。⑨PBS缓冲液：NaCl8g，KCl0.2g，Na2HPO41.44g，KH2PO40.24g，调节pH至7.2，定容至1L。四．试验方法：1.发酵实验：（1）将验证成功的含阳性重组质粒pET-GK的BL21接种于5mL含5μL的0.1g/mLKana的LB液体培养基中，接种3管，摇床37ºC、200rpm培养12h；（2）取过夜培养后的菌液100μl在含有0.1g/mLKana的LB液体药瓶培养基中，37ºC、200rpm培养到OD（λ=595nm）值为0.4-0.6时，加入终浓度为1.0mM的IPTG（60µL）诱导表达6h；（3）对诱导表达后的菌液用高速冷冻离心机4ºC7500rpm离心20min，得菌体沉淀，再用灭菌的双蒸水漂洗2-3次，4ºC7500rpm离心20min最后收集菌体沉淀；（4）将所得菌体沉淀转移至预冷的研钵中，加入2mL50mM磷酸缓冲液（pH7.8）、400µL的高缓冲液和少许的SiO2在冰浴下进行研磨直至菌体成为匀浆液，大约25min（为保证研磨效果，最好延长研磨时间至35min），研磨结束后，收集研磨所得的匀浆，再用1mL的高缓冲液清洗研钵底部残留的菌体，一并转入5mL的离心管中；（5）将离心管用封口膜封好，用超声波清洗机超声裂解破碎细胞（超声波裂解时，需于水槽内放置冰袋），破2min停1min，重复5-6次，超声裂解后，于4ºC，12000rpm离心10min，收集上清液即为所得粗蛋白。2.蛋白纯化：（1）加柱子：取3mL的Ni-NTA树脂填料装入层析柱内，让储存缓冲液通过重力流从脂中慢慢流出，加45mL的0.5MNaOH洗脱，同时控制流速为1mL/min，再加30mL的PBS洗脱；（2）柱平衡和上样：加6mL的Binding/washbuffer洗脱平衡柱子，然后将粗蛋白溶液和Binding/washbuffer等体积混合加入介质内，流尽后在用Binding/washbuffer进行洗脱至平衡，约3h；（3）洗脱：分别用40、100和250mM的Elutionbuffer洗涤树脂，从脂内洗脱蛋白，并分别收集各梯度缓冲液洗脱液，每1min更替一个收集管，同时测定各管内洗脱液在λ=595nm的吸光度，以检测蛋白洗脱情况，直至洗脱吸光值为零时，进行更高梯度的缓冲液逐次洗脱；（4）检测：对收集管里测得吸光值不为零的进行SDS-PAGE